NaCl离心法去除质粒DNA制备物中的小片段核酸实验一NaCl离心法去除质粒DNA制备物中的小片段核酸
| 实验方法原理 | 常规的质粒DNA制备物中都会不同程度地污染有来自宿主菌基因组或质粒断裂碎片的小分子DNA或RNA。尽管它们的分子质量不大，但数量多，会对制备物中DNA片段3"和5"端的总量产生明显影响。 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 乙醇NaCl乙酸钠TE胰RNase 仪器、耗材 | BeckmanSW50.1转子 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶剂 乙醇，NaCl（1mol/L，用TE(pH8.0)配制），乙酸钠（3mol/L，pH5.2)，TE(pH8.0)。 2.酶和缓冲液 无DNase的胰RNase 3.核酸和寡核苷酸 DNA样品，CsCl密度梯度离心纯化 4.离心机和转子 BeckmanSW50.1转子或可适用相应离心管的替代转子，SorvsllSS-34转子或性能相同的替代转子 二、方法 1.测定质粒制备物体积。加入0.1倍体积的3moI/L乙酸钠（pH5.2)和2倍体积的乙醇，混匀后于4℃放置30min。 2.于4℃用大于10000g(转速大于9100r/min时用SorvallSS-34转子）离心15min,回收核酸沉淀，尽可能去掉上清液，然后打开管口，在工作台上放置几分钟，使最后残留的微量乙醇蒸发殆尽。 3.用0.5~1mlTE(pH8.0）溶解潮湿的DNA沉淀。 质粒DNA浓度应不少于100μg/ml。 4.加无DNase的RNase至终浓度为10μg/ml，室温温育1h。 5.准备一个BeckmanSW50.1离心管（或相当的离心管）加入4ml含1mol/LNaCl的TE(pH8.0)，用带有一次性吸头的自动移液器在1mol/LNaCl溶液上部加铺一层1ml经RNA酶处理过的质粒DNA样品。必要时，可酌情用TE(pH8.0)充满离心管。 6.于20℃用大于150000g（转速大于40000r/min时，用BeckmanSW50.1转子）离心6h,小心去掉上清液。 质粒DNA沉淀在管底，而寡核苷酸和小片段DNA留在上清中。 7.用0.5mlTE(pH8.0）重新溶解质粒DNA沉淀，加50μl3mol/L乙酸钠（pH5.2),将DNA溶液转移到微量离心管中。 8.加2倍体积的乙醇，于4℃放置10min,沉淀DNA。然后于4℃以大于10000g离心15min,尽量去尽上清液，打开管口，放置在工作台上放置几分钟，让最后残留的痕量乙醇蒸发殆尽。 9.用TE(pH8.0)溶解潮湿的质粒DNA沉淀。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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