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大肠杆菌转化实验一热击法
来自 : 蚂蚁淘
实验方法原理质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、实验材料准备

1. 器材
 
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。
 
2. 试剂
 
培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O,IPTG,X-gal。
 
3. 材料处理

无菌ddH2O,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2%X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。
 
二、操作步骤
 
1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
 
2. 从-70℃超低温冰柜中取出一管(100μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10min。
 
3. 加入5μl连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng),轻轻震荡后放置冰上20min。
 
4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5min。
 
5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μlLB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。
 
6. 在超净工作台中取上述转化混合液100-300μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
 
7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40μl2%X-gal,8μl20%IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
 
8. 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30~60min直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
 
9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。
 
10. 观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
注意事项
1. 玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂。
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