大肠杆菌转化实验一高效率电转化法
| 实验材料 | 大肠杆菌 试剂、试剂盒 | LBSOC 仪器、耗材 | 电转化仪离心机分光光度计 实验步骤 | 1. 接种一个单菌落于5mlLB培养液，37℃温和振摇培养5h或过夜。 2. 将2.5ml培养物加人到盛有500mlLB培养液的2L烧瓶中，37℃摇匀振荡培养至OD600为0.5~0.6。 3. 细菌在冰水浴冷却10~15min，然后转移到预冷的1升离心瓶中。于2℃，5000g离心20min沉淀用5ml预冷的水溶解6。 4. 加入500ml冰冷的水，混匀，按步骤3重复离心1次，立即将上清倒掉，用残余的液体重悬细胞。 5. 新鲜制得的细菌 （1）将悬浮液加入到预冷的50ml聚丙烯管中，2℃，5000g离心10min。 （2）估计细胞沉淀的体积，沉淀用等体积的冰冷水重悬。 （3）按50~300μl分装于预冷的微量离心管中。 6. 冻存细菌 （1）加入40ml冰冷的10%甘油，混合，然后按照步骤5离心。 （2）估计沉淀的体积，然后加入等体积的冰冷的10%甘油，重悬菌体。 （3）按50~300μl分装于预冷的微量离心管中。 （4）于干冰上冷冻并贮存于-80℃。 7. 将电转化仪调到2.5kV、25μF，脉冲控制器调到200~400Ω。 8. 将1μl质粒DNA加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中，混匀。 9. 将转化混合物转移到预冷的电转化池中，吸干池的外表面，然后放入样品槽中。 10. 进行脉冲电转化，然后取出电转化池，马上加入1mlSOC培养液，并且用巴斯德吸管转移到无菌的培养管中。 11. 于37℃，中速振荡培养30~60min。 12. 分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。 |
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发布于 ： 2021-07-17
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