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蛋白质定量实验一考马斯亮蓝蛋白质浓度分析法
来自 : 蚂蚁淘
试剂、试剂盒
实验步骤
(1)准备100~1500ug/ml的标准品,溶于Bradford法相兼容缓冲液中。对于较稀的样品,可能通过增加样品在试剂体积中的比率而扩大灵敏度(microBradfordassay:1~25ug/mL)。如果样品与染料的比值太高,可能会增加反应混合物的PH而导致反应背景较高。

(2)将标准品和待测样品加人到一次性的比色皿中(应该使用一次性的塑料比色皿或微孔板,因为染料会黏附到各种材料容器的表面上)。

(3)Bradford试剂预热至室温。将ImL染料溶液加人到25uL蛋白质样品中,混勻,室温孵育10min。

(4)检测450rnn和595nm处的吸光度(可以使用570~610nm的基于滤光器的仪器,对检测性能不会有明显的降低)。

(5)对595nm处的数据作图,或为提高在低反应值处的精度,对595nm/450nm的比率作图。标准反应曲线可以拟合为一个多项式反应,由此可以估算出待测样品的浓度值.
注意事项
Bradford法的优点有操作方便、灵敏度高和试剂的成本低等。对基于微孔板的检测,试剂的总体积可以减少到300由于大多数微孔板分光光度计光源的路径是垂直的,建议使用商业来源的Bradford试剂,以减少在长期储存过程中发生的沉淀。

我们观察到各种市售的Bradford制剂的反应存在着显著的差别(Nobleetal.,2007)。在分析低分子质量的蛋白质或多肽时这种差异更加显著。事实上,据报道,这种方法在应用中存在一个检测分子质量的下限,也就是「阈值」,需要一定数量的特定残基以形成可检测到的信号(deMorenoetal.,1986)。有报道称,Bradford试剂成分的改变会引起特定蛋白质反应的改变。因此,当比较不同供应商或不同制剂的Bradford数据时应该特别注意(Chanetal.,1995;FriedenauerandBerlet,1989;Lopezetal.,1993;ReadandNorthcote,1981)。

Bradford法对各种试剂的干扰是敏感的,详见表8.1,其中包括大多离子去污剂和非离子去污剂,以及糖基化的蛋白质。如果反应混合物发生沉淀,如检测疏水蛋白或膜蛋白时,反应体系中可以添加5%?10%(V/V)的Imol/LNaOH来助溶。
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