一、酶活性的检测

为了检测一种酶的催化活性，有必要首先鉴定从底物(S)到产物(P)转化所包含的化学变化。迄今为止，在各种关于酶催化活性文章的相关论述中，最典型的分类方式是按照其所催化的化学反应的类型来进行的(如氧化-还原、基团转移、消除、异构化、重排、缩合、竣化作用等)（FreyandHegeman，2007)。此外，还应该考虑是否存在机制相似的化学过程:①涉及小分子底物或大分子蛋白质或核酸;②在溶液中易于发生或需要膜结合组分才能进行;③逆反应进行到多大的程度。在任何情况下，酶的分析围绕着以可计量的方式将给定底物和相关产物的理化性质进行区分的能力来设计(EisenthaUndDans0n,2002;Rossomando,1990)。在很大程度上，类似的活性检测方法已经应用于这些亚群中的各种酶。在以某种已有检测方法为基础来为下面两类酶首次设计检测方法时要慎重，即不同物种来源的同源酶或催化相关化学反应的不同的酶。酶活性检测的中心主题是确保初始速率的测定。为了重申这一要点，常见的和较好的做法是,在具有小于等于5%产物转化的时间内测定反应物减少或产物生成的初始速率。这种做法可以给出在初始底物浓度条件下的最接近起始反应速率的值。

连续性检测

查阅关于酶检测的文献后，你可能会找到很多合适的检测酶的方法,这些方法可能会根据是否使用「连续」或「间断」的分析方法而被初步加以区别。连续检测被定义为能够连续监测一个给定底物消失或产物出现的方法;它们通常依赖于光谱技术，如电子紫外-可见光吸收和荧光发射。对于吸收光谱法，摩尔吸收消光系数(s)可以为有共轭键系统的任何数量的化合物进行质量测定。根据朗伯-比尔定律（Lambert-Beerrelationship)(A=ecl),吸光度(A，无单位)与以下几个方面成正比:①摩尔消光系数[e，L/(mol·cm)];②该化合物的浓度(c，mol/L);③用于测量的比色皿的径长G,cm)(Segal,1976)。因此，物质的量浓度随着时间或初始速率(口=一d[S]/df或d[P]/cb)的变化直接由在指定波长上的光谱信号变化[时间(dA/ck)除以的斜率来计算。而酶的活性最终由初始速率除以酶的物质的量浓度(mol/L)或除以所检测的总蛋白的质量浓度(mg/mL)[分别根据式(7.11)或式(7.12)]来获得。

紫外-可见光吸收光谱法虽然方便进行连续监测和就测定浓度变化来说是准确的，然而对于可检测的酶-底物复合物(ES)和产物的数量以及能够精确检测的浓度范围来说是有局限的。另外，荧光和憐光光谱可用于对反应过程的连续监测,并在大多数情况下提供显著增强的检测灵敏度。然而,必须指出的是，荧光基团的浓度不能通过应用一个相当于摩尔消光系数的普适常量所定量的荧光发射值来进行计算。相反,荧光发射随时间的相对变化可以进行比较。无论如何，荧光和磷光光谱非常适合于利用高通量平台筛选大量复合物中对酶活性有影响的物质。作为药物靶标的大量酶(特别是蛋白激酶和蛋白酶），对人工肽底物进行化学修饰，以获得一个或多个小分子荧光基团;而这些底物在磷酸化或裂解时会发生荧光发射的变化。在使用基于荧光或磷光的分析之前，研究人员应该彻底地查阅有关这些原理的文献，必须考虑多种性质(如荧光寿命、量子产率和内滤效应）（La-kowicz,2004)。最后,应该指明的是，众多的「连续」酶法检测能够并已发展到应用于检测没有光谱性质的底物-产物对的反应。在这些情况下，酶的反应体系中包含一个或多个额外的酶，这些酶能与反应中一个给定的产物偶联,可使其得到一个称心的光谱性质(EisenthalandDanson，2002)。在极大程度上，这样偶联的连续检测方法（COUpledcontinuousassay)已被应用于代谢酶的检测，要求是这些酶的特定产物能够被生色反应的辅酶类[如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)]等氧化或还原。如果反应产物不是一个直接的显色底物，那么一个额外的酶可能会被引人，用于将该产物转化为可以发生显色反应的底物。在任何情况下，必须确保反应混合物包含足量的附加组分，以确保反应速率完全是由感兴趣的酶单独决定的。换句话说，检测的反应速率应该:①仅依赖目标底物（S)和酶浓度；②不依赖或零级于*为方便偶联反应而加入的每一个组分的浓度。

不连续性检测

不连续性检测定义为因不能连续的监测而选择性的对底物或产物的浓度变化进行监测。例如，当一个给定的底物-产物对光谱性质相似或均不具有光谱性质时可采用此类检测。当然，酶促反应必须在不同的时间点上进行人为的停止或「淬火」（quenched)。然后对「淬火」的样品使用一些方法进行处理，通过这些处理，产物能够有效地从底物中分离，因此，每个时间点上产物和底物的浓度变化就能够被检测到。在建立一个非连续性的酶学测定时，两个方面的设计是关键的:①在特定的时间点上有效的停止或「淬火」酶催化的反应;②从少量形成的用以检测初始反应速率所需的产物(<5%)中有效的去除大量未反应的底物(>95%)。这两个方法的要点必须同时被考虑,因为「淬火」后的反应溶液条件必须适用于接下来的步骤，即将底物和产物分离。由于在各种条件下大量的酶能够迅速失活(如加入酸、碱或金属螯合剂等）,所以底物和产物的分离是首要考虑的问题。

高效液相色谱（HPLC)在分辨能力和检测灵敏度上都提供了很宽的范围(McMaster，2007)。例如，包含有小分子物质或大分子物质的各种混合物都能够在其通过一个装有特定固定相的层析柱(如离子交换、尺寸排阻或反相层析)时，根据不同的保留时间而被相互分离。另外，HPLC系统可安装任意数量的探测器，因此，一个给定光谱性质的化合物在它从层析柱上洗脱下来时可被检测，导致产生一个光谱峰。为了精确计算产物的量，可将已知不同浓度的产物所得出的各峰的积分绘制标准曲线，同时将检测产物的峰进行积分，并与标准曲线相比较。如果指定的产物没有展示出任何光谱性质，可以考虑以下两种方法:①化学修饰底物使其包含一个光谱活性的化合物;②修饰「淬火」后反应混合物中的产物。在后一种情况下，必须确定所有的产物都被修饰，同时，修饰后的产物能够很容易地从剩余的未反应的光谱活性化合物中分离。酶活性的检测可通过式(7.11)和式(7.12)准确地实现，不同之处是将dAAfe用AA/代替(即单点的检测，而不是根据多点的斜率检测当一个给定的底物-产物对没有展现出有用的光谱性质时，在不连续性检测中某个给定时间点上产物的量可以通过放射分析来检测（EisenthalandDanson,2002)。事实上，放射分析提供了最高等级的灵敏度，并表现出最高等级的广泛实用性。几乎所有酶的底物都可以被合成，并在其即将在酶促反应中经历转移的基团上加入一个同位素原子(rADIoisotope)，它能够在极微量的情况下被检测到。用于酶检测的最常用同位素是3H、14C、32P和3SS。对于这4种放射性元素，不稳定的原子核会发生缓慢的一级衰减，经过一个被称为卩粒子放射的过程，形成稳定的同位素，其原子质量与原本的原子相同，但原子数要高一位。对P粒子的发射进行闪烁计数为检测一个样品的放射性总量提供了一个很灵敏方法,它直接由次每分钟(cpm)来定量。同位素的半衰期U1_)是一半的原子发生衰变时所需要的时间。3H01/2=12.3年）、14C(~2=5700年）、32POv2=M.3天)及35SOl2=87.1天)的半衰期已经被准确测定。从这些数值可以看出，3H和14C排放的放射性总量在常规的实验室工作时间过程中没有明显的改变，而32P和S排放的放射性总量在同样的时间内会明显的降低。

制造商将这样的同位素结合到目的分子的指定位置，以获得放射性标记的底物分子，它们具有确定的放射活性specific(radio)activity，SA(Segal,1976)。比放射性是指每单位分子(mol)所具有的放射性(cpm)的总和。通常情况下，将小量高放射性的「热」底物分子添加到大量无放射性的「冷」底物分子中。然后对已知浓度的小体积样品进行闪烁计数，以确定底物的放射活性(SAS，cpm/mol)。通过控制热、冷底物分子混合比例,能够产生一个很宽范围的放射活性，因此，酶活性的检测能够在相同的底物浓度区间内进行。例如，SA=1000cpm/mmol的放射性标记底物能够有效地检测由标记转移而形成的1mmol的产物(1000cpm),而产生SA=IOOOcpm/pmol的放射性标记底物可以有效地检测Ipmol产物。

通常情况下，当产物形式的分子保持于固体载体(如离子交换树脂、纸片或圆盘)的表面，而底物形式的分子游离存在时,可以使用离子交换方法。其他的分离方法可能包括选择性沉淀、溶剂萃取、凝胶电泳等。在进行酶催化反应之前,有必要确定:①放射性标记的产物与具有放射活性的底物可很好的分离;②可进行辨别的产物的量接近于受试对象的总量。通常情况下，要找到一个妥协点，在这个点上，特定的最低量的底物放射「背景」在介质中或在产物被检测的位置上是可接受的。为了进行最准确的分析，要将包含有纯化产物的介质直接进行闪烁计数分析(如离子交换树脂、纸片或圆盘)。尽管电泳后所选择的凝胶区域可以从凝胶中分离出来并直接进行计数，然而，更普遍的做法是使用闪烁板和计算机密度分析对整个凝胶进行空间的放射性定量。

用于进行分析的部分样品中酶所催化的产物的量(mol),通过将产物组分中检测到的放射性总量除以底物的比放射性(cpm/mol)来进行计算;产物的浓度[P],通过将产物的总量除以其所在的体积(L)而得到;初始速率d[P]/cU，通过进一步将[P]除以反应时间(s)而得到。因此，酶的活性最终通过初始速率除以依据式(7.13)的酶的物质的量浓度或依照式(7.14)的总蛋白质浓度而得到。

二、反应分析混合物的组成

在已经建立了有效的反应物解析、检测和定量方法的前提下，接下来要做的是考虑反应体系本身的配制问题。对于连续的光谱分析，样品的总体积应与所给光谱仪的比色皿的体积相对应。对于可见光吸收的检测(>325nm)，为了操作简便，IinL的一次性塑料比色皿使用得最广泛。由于塑料比色皿增加了对短波长光波的吸收，所以石英比色皿更适用于该光谱范围的检测。随着配有全自动定量绘图酶标仪的荧光计的可用性及实用性的增加，实现了在一个微孔板上同时获得大量小体积反应≤50ul的准确放射读数。对于不连续性的酶分析方法，反应混合物的总体积应能确保有多个(>3)特定的定量等分以便可以在不同的时间点取出，进行反应猝灭及产物分析。

对于所有的酶学检测，要准备适当浓度的缓冲液、底物及酶的储存液，从而在配制反应体系时,可在所加人各组分的体积之和小于总反应体积的情况下使每种成分稀释到所需的浓度。剩余的体积用水补齐。缓冲液的PKa应在反应所需pH的±1的范围内，它的浓度应超过所有含电离基团的其他任何组分。缓冲液储存液中还应包含有维持酶活性和稳定性所必需的其他化合物，如盐类(如NaCl或KC1)、渗透剂（osmolyte)(聚乙二醇、甘油、蔗糖)及还原剂[(如(3-巯基乙醇、二硫苏糖醇或磷酸三氯乙酯(TCEP)]。在制备缓冲液储存液时加入这些组分非常必要。而最终的缓冲液储存液混合物应在反应实际发生的温度下滴定到所需的pH。使用以下缓冲液时应特别注意:①含氮缓冲液(如Tris)的?尺3对温度很敏感;②磷酸盐缓冲液的pKa对离子强度特别敏感。事实上，磷酸盐缓冲液的稀释会改变其pH,因此，储存液浓度下的pH必须作相应的调整。

配制反应混合物最好首先加人非酶的组分，按照以下的顺序:①特定体积的水;②特定体积的缓冲液储存液混合物;③特定体积的底物储存液。最好准备酶的储存液,以便只要往混合物中加人相对少量(<10%体积)的酶以达到指定的总体积而开始进行反应。在把酶加入到混合物中并开始一个连续性的检测时，比色皿或微孔板应立即插入到光谱仪中，按程序开始在指定波长上采集吸收数据或发射数据。对于非连续性分析，应该准备从反应混合物中吸出精确体积的样品,并与精确体积的淬火剂混合，这些操作必须在确定的时间点上重复。在所有的酶的分析中,应该额外配制一个不含有酶的对照组反应混合物，以确定以下实验「背景」:①非经酶催化产物的形成;②因不完全辨别而引起的信号保留。

任何这样的背景必须从含有酶的样品所检测到的信号中消除。

三、讨论

本章介绍了测量酶反应速率的最根本的原理，但它们绝不是这个主题的全部。尽管如此，清楚了解这些原则对有效的利用成熟的分析方法或为新发现的酶建立有效的分析方法是完全必要的。在过去的一个世纪中，无数的研究文章、综述、书籍的章节，甚至是整本的书对酶活性检测的开发、利用和解释进行了报告。本文所引用书的章节或文章为关于检测酶活性的各种话题提供了更综合的论述。