细胞增殖生长方面实验一接种存活率和克隆形成率法
| 实验方法原理 | 细胞被制成分散的悬液后，以低密度（2～5个细胞/cm2）被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群（克隆）的细胞百分数值称接种存活率，用以表示细胞群的活力。由于检测接种存活率时是借观察克隆（通常为16～50个细胞）形成情况，又因每个克隆都来自一个细胞，因此也称克隆形成率。细胞接种存活率与细胞活力成正比。 如细胞冻存复苏后接种再培养时，常测定细胞接种率（SeedingEfficiency），即接种后细胞贴壁数。  细胞接种率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，从而细胞接种率和细胞接种存活率不完全相同。接种存活率在意义上虽与克隆形成率相同，但隆形成率概念更明确。形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞，因此用克隆形成率一词表示细胞活力更为准确。 克隆形成率与众多因素相关；从条件来说与底物、培养液、血清的量和质等有关；也受温度和pH的影响。从细胞方面，克隆形成率反映细胞的两个重要性状，即群体依赖性和增殖能力。一般初代培养细胞弱，传代细胞系强；二倍体细胞弱，转化细胞系强；正常细胞弱，肿瘤细胞强。即随细胞生物学性状的不同，细胞克隆形成率差别很大；另外所有细胞的克隆形成率又受接种细胞密度的影响。 | ||||||||
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| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | 醋酸甲醇Giemsa琼脂DME 仪器、耗材 | 玻璃塑料板CO2温箱 实验步骤 | 一、冻存技术不良或细胞生活力弱时可降低接种存活率 为获得确切的接种存活率，接种时一定要接种分散为单细胞悬液。一般情况下把细胞直接接种在碟皿中即可。细胞接种密度和克隆形成率有一定关系。做克隆率测定时，一般持续一周，期间随时检查，到细胞形成克隆时终止培养，固定染色。 1. 细胞 80%～90%汇合细胞； 2. 悬液制备 用消化法制备成单细胞悬液，接种到适宜底物（玻璃或塑料瓶皿）；用多孔塑料板亦可（每孔底面积不宜小于1mm2）； 3. 培养 置温箱中培养； 4. 观察 隔48～96小时，见细胞克隆已形成，终止培养；1：3醋酸甲醇固定、Giemsa染色、镜下观察、计算克隆数。 二、软琼脂培养 特别是双层软琼脂培养，仍为当前检测转化细胞和肿瘤细胞最为常用的方法，与细胞恶性程度有很大的符合率。 2. 无菌制备出2×DME（含有2×抗生康和20%的小牛血清），保存在37℃中； 3. 底层琼脂制备 按1：1混合1.2%的琼脂糖和2×DME后，取3ml混合液注入直径6cm平皿中（如为10cm平皿则加7～10ml），令冷却凝固、置CO2温箱中备用； 4. 消化细胞 用营养液制成细胞悬液、计数； 5. 顶层琼脂制备 按1：1比例让0.7%琼脂和2×DME在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2ml的细胞悬液，充分混均、注入已铺有1.2%琼脂糖底层平皿中（直径6cm平皿加3ml；10cm平皿加7～10ml），遂形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃CO2温箱中，培养10天～14天； 6. 观察细胞集落。 注意事项 | 1. 确定克隆无绝对标准，一般情况下不能少于8或10个以上的细胞群才算作一个克隆；克隆检测宜用低倍镜，用解剖镜检查甚好。 2. 制备细胞悬液要求一定做到为单细胞，如分散不好，有很多两个以上的细胞团，接种后可导致克隆形成不均，将出现人为误差。 3. 接种密度不能过大，在细胞过密情况下，细胞克隆相互界限不清或易发生早期汇合。 4. 琼脂与细胞相混时，温度不宜超过40℃以免烫伤细胞。 5. 接种细胞密度每平方厘米最好不超过35个；在直径6cm的平皿应接种细胞1000个。 6. 上层琼脂中含有细胞，因琼脂为半流体，细胞悬于琼脂中不下沉；如分散和混合良好，则细胞被均匀互相隔离；因两层琼脂中都含有DME，细胞可获充分营养进行增殖生长。 |
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发布于 ： 2018-08-03
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