抗原特异性T细胞克隆制备实验一间歇循环刺激法
| 实验方法原理 | 间歇循环刺激法是制备抗原特异性T细胞克隆的传统方法，即经抗原间隔刺激多个循环。 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | MNC抗原 试剂、试剂盒 | RPMI1640培养液 仪器、耗材 | 24孔培养板37℃恒温箱96孔培养板 实验步骤 | 一、材料和试剂 1. 抗原致敏供者的单个核细胞(MNC)和经过3300rad照射的自身MNC 2. 抗原 3. 含10%人AB型血清的完全RPMI1640培养液 二、操作步骤 1. 抗原刺激：于24孔培养板加入单个核细胞5×106/2ml/孔和最适浓度的抗原，置37℃，5%CO2温箱培养7d。 2. 间歇循环刺激： （1）重悬经过抗原刺激的细胞，并经密度梯度离心，收集界面层细胞，用无血清的RPMI-1640洗二次； （2）调整细胞浓度至1×106/ml，加入24孔培养板孔中，同时各孔加入经过照射的自身MNC4×106，以未照射的自身细胞作为饲养细胞和抗原提呈细胞，培养7d； （3）同步骤（1）收集和洗涤细胞； （4）调整细胞浓度至1×106/ml，与2～3×106新鲜照射的自身MNC及抗原共同培养7d； （5）重复步骤（2）～（4）共3个循环； （6）收集细胞，通过增殖试验测定抗原的特异性。 3. T细胞克隆：间歇循环刺激培养的细胞经有限稀释，于96孔板依次加入不同浓度的细胞悬液，同时克隆板孔中加入104经过照射的自身MNC、IL-230U和适当浓度的抗原，同上述条件培养7～10d，显微镜下观察细胞生长情况。将生长良好的抗原特异性细胞转至24孔板孔中，加入自身饲养细胞和抗原，继续培养7d，传代并经间歇刺激培养。 注意事项 | 1. 上述方法制备的T细胞克隆未区分出CD4+和CD8+T细胞，二者均可能被克隆。 2. 在有限稀释之前，IL-2的量不宜过高，否则可能发生T细胞非特异性增殖。 |
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发布于 ： 2018-08-03
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