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存在干扰物质条件下的蛋白质浓度测定实验
来自 : 蚂蚁淘
试剂、试剂盒
实验步骤
材料

牛血清白蛋白(BSA)

脱氧胆酸钠(0.15%)

三氯乙酸钠(TCA;72%)

试剂

试剂A

试剂B

(配方,见“试剂的配制”pp.234~240)

操作程序

1)用蒸馏水配制lmg/mlBSA溶液,分装,冻存于-20°C备用。

2)作标准曲线,于1.5-ml微量离心管中配制下列混合物:

3)用蒸馏水稀释膜蛋白样品(1:10),分別取5-ul、10-ul、20-ul等分试样供测定。对于已溶的膜蛋白或WGA柱层析组分,不必稀释,取10ul即可。另取10ul缓冲液于空白对照管,用以测定缓冲液组分的吸收值。
注:如无干扰物质、其含量可忽略或经适当控制,则第4~8步可省略。在这样的情况下,用蒸馏水将每个样品稀释至0.4ml。

4)用蒸馏水稀释膜蛋白样品至1ml。

5)每管加0.1ml0.15%脱氧胆酸钠。混合,室溫放置10min。

6)每管加0.1ml72%TCA。混合,室温下微型离心机离心15min。

7)弃上清。可有效地用吸管吸出。

8)每管加0.4ml蒸馏水。

9)每管加0.4ml试剂A,震荡混匀,室温放置10min。

10)每管加0.2ml试剂B,立即混合。室温孵育30min。

11)750nm下读吸光度。
注:在2h之内读吸光度,除非各样品组中都包含有标准蛋白样品。室温下每小时腿色为1%~2%,将8~10步的体积缩小10倍,增加其灵敏度,此法可容易地转为微量测定。除作标准曲线时,蛋白用量减为0.1~10ug外,1~7步均与常量测定同。

12)以标准样品管中的蛋白量对750nm吸光度作图,绘出标准曲线。

13)根据各被测样品在750nm处的吸光度,从标准曲线査出该样品的蛋白含量。
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