胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验
| 实验方法原理 | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 纯化的鼠肝细胞质膜部分纯化的胰岛素受体纯化的胰岛素受体[125I]胰岛素猪胰岛素双琥珀酰亚胺酰辛二酸二甲亚砜NH4Cl甘油SDS-PAGE样品缓冲液 仪器、耗材 | 蛋白质凝胶电泳装置干胶器 实验步骤 | 材料与设备 纯化的鼠肝细胞质膜（见本单元实验1) 部分纯化的胰岛素受体，得自WGA-琼脂糖柱层析（见本单元实验3) 纯化的胰岛素受体，得自胰岛素琼脂糖柱层析（见本单元实验4) [125I]胰岛素（受体级）（DuPontNENNEX196) 猪胰岛素（17.5umol/L)(如，SigmaChemicalCo.13505) 双琥珀酰亚胺酰辛二酸（PierceChemicalCo.21555) 二甲亚砜（DMSO) NH4Cl(1mol/L) 甘油（10%;v/v) 蛋白质凝胶电泳装置（BioRadLaboratories或HoeferScientificInstruments) 干胶器(Bio-RadLaboratories或HoeferScientificInstruments) 试剂 SDS-PAGE样品缓冲液（5x) (配方，见“试剂的配制”，pp.234~240) 操作程序 1）建立如下反应体系:  2)反应混合物于室温孵育2h。 3)溶双琥珀酰亚胺酰辛二酸于DMSO中，使终浓度为10mmol/L。 4)每管加入6ul10mmol/L双琥珀酰亚胺酰辛二酸，室温孵育1min。 5)加1ul1mol/LNH4Cl终止反应。 6)加15ul5xSDS-PAGE样品缓冲液。 7)样品煮沸5min。 8)加样至7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。170V电压下电泳，至染料前沿跑出凝胶。（关于SDS-PAGE的详细资料，见附录5) 9)将凝胶置10%甘油中孵育后，在干胶器上干燥。 注：蛋白质也可转移至硝酸纤维素膜上，如本单元实验6所述。 10）用放射自显影法鉴定亲和标记的胰岛素受体。 结果 交联实验的典型结果如图4-6所示。  |
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发布于 ： 2018-08-03
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