核纤层和富含核纤层组分的制备实验一SPISULA
| 实验材料 | 海蚌 试剂、试剂盒 | 溶液S 仪器、耗材 | Millipore滤器离心机 实验步骤 | 卵母细胞收集和制备 1.从成年海蚌中剥离卵巢和卵母细胞。然后在1g重力作用下，用经0.22μmMillipore滤器过滤的海水清冼几次卵母细胞。 匀浆 2.为了在不激活卵母细胞的情况下使卵黄膜去稳定，将洗过的卵母细胞悬浮于含1.4mol/L甘油，15mmol/LNaHPO4，pH8.0，和40μg/ml五羟黄酮的溶液中，室温孵育8分钟。 3.500g离心2分钟收集卵母细胞，在最少量（例如，0.5倍体积）的溶液S中轻轻地吹打进行重悬浮。 溶液S： 0.25mol/L蔗糖 5mmol/LPIPES，pH7.2 0.75mmol/LMgCl2 0.5%(w/v)NP-40 0.5mmol/LFMSF 4.加入溶液S使卵母细胞最终稀释20倍，轻轻吹打以混合悬液，这样在1分钟之内会裂解卵母细胞。 分离细胞核 5.将卵母细胞裂解液加到等体积的溶液T上，用BeckmanTJ-6离心机在1800r/min离心10分钟以分离细胞核。 溶液T： 0.4mol/L蔗糖 5mmol/LPIPES，pH7.2 0.35mmol/LMgCl2 0.5mmol/LPMSF 6.仔细地弃去无细胞核上清，用溶液S(总共20倍体积）重悬浮含细胞核的沉淀，重复第5步的离心步骤。 用核酸酶处理纯化的细胞核 7.用1倍体积的含0.25mol/L蔗糖，5mmol/LPTPES，pH7.2，0.35mmol/LMgCl2和1%Trasylol的溶液重悬浮细胞核。 8.在重悬浮的细胞核中，加入DNA酶Ⅰ和RNA酶A至终浓度为20μg/ml，室温孵育30分钟。 用1.5mol/LNaCl抽提核酸酶处理的细胞核 9.将等体积的（1倍体积）含3mol/LNaCl，20mmol/LPIPES，pH8.0，2mmol/LEDTA和0.5mmol/LPMSF的溶液与含核酸酶的细胞核悬液混合。 10.将悬液加到等体积的含1.5mol/LNaCl，10mmol/LPIPES，pH8.0，1mmol/LEDTA，0.25mmol/LPMSF和0.44mol/L蔗糖的溶液上，用SorvallHB-4转头在11000r/min离心30分钟。 11.用1倍体积的5mmol/LPIPES，pH7.2溶液清洗一遍富含细胞核纤层的沉淀。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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