植物总DNA的快速少量抽提实验一CTAB法
| 实验方法原理 | CTAB法：该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作)。 CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65°C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 水稻叶片 试剂、试剂盒 | 液氮CTAB氯仿异戊醇乙醇NH4ACEtOH 仪器、耗材 | 离心管离心机 实验步骤 | 1. 采集适量幼嫩叶片，用液N2研成粉末，0.4 g装入1.5ml离心管中（-20℃预冷）。 2. 预热1.5×CTAB到95℃，加1ml到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防止冻融）。 3. 立即置于65℃水浴30min，每5分钟，上下颠倒1次。 4. 12000g离心5分钟。 5. 吸取上清液约600μl，加入等体积（600 μl）氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。 6. 12000g离心5分钟。 7. 取450 μl上清于一新1.5ml离心管，加入1ml 95%乙醇和45 μl 10M NH4AC），混匀，室温放置10min。 8. 12000 g离心10min，去上清，用75% EtOH浸洗沉淀，自然干燥约30 min。 9. 加入50 μl 1/10 TE或无菌水（含20mM/RNase），置于4℃过夜，待DNA溶解后，检测DNA浓度及质量。 注意事项 | 1. 尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10 mM的β-ME处理。 2. 研钵预冻，粉末至加CTAB前不要融化。 3. 24:1的氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的。 4. 所用试剂必需灭菌，手套。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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