特殊细胞培养实验一微载体细胞培养法
| 实验方法原理 | 微载体细胞培养开始于60年代末期，最早使用离子交换凝胶作为载体，轻微搅动即可悬液在培养基中，因而可增加细胞附着的面积，达到大量培养细胞的目的。后来，根据细胞附着生长的特点，对微载体进行了改良，使其带有电荷或其它介质，更利于细胞附着和生长。 这一方法亦可用于常规量的培养，也可用于大规模的培养，具有操作简便和不易污染的优点。利用此法已成功地从猴肾细胞中生产疱疹病毒疫苗和从培养细胞中生产出人β型干扰素。 | ||||
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| 试剂、试剂盒 | 微载体PBS酒精 仪器、耗材 | 培养基 实验步骤 | 用微载体细胞培养的主要问题是选择合适类型的微载体和适宜的搅动速度。三种类型微载体都适宜各类细胞生长，目的在于如何获得最大量的细胞。另外应注意的是微载体对蛋白有一定的吸附能力，它们吸附率分别是总蛋白的4.3%、2.7%、1.1%。所以使用血清的量最好不低于10%。 1. 微载体选择 （1）先利用三种小量微载体做培养实验，观察细胞在一定时间内细胞的附着率和计算细胞数，以得到最大量细胞为佳。 （2）通常是绘出生长曲线以比较它们容纳细胞量的大小、微载体的用量和搅动的速度等。以能完全悬浮在培养基内效果最好。 2. 水化和消毒 （1）微载体水化过程要用玻璃容器，如有可能使用“硅化”的玻璃容器更好。这是因微载体颗粒小且轻，细胞吸附到表面后难以洗脱下来。 （2）水化时，首先称一定量的微载体放入容器中，按每克微载体加50~100ml的比例，加入无Ca2+和M2+的磷酸缓冲液（PBS），室温下放置应不少于3小时，并不时轻微搅动，然后再用新鲜PBS洗一次（30~50ml/g干粉）。如用Ⅲ型微载体，在水化作用时，表面不易湿润而易出现沉淀。因此加入PBS后，加数滴吐温80（2~3滴/100ml）。 （3）消毒方法可采用高压蒸气消毒（15磅，15分钟）。亦可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用无菌的PBS漂洗一二次。微载体在培养基内呈悬浮状态时，才能有效地增加细胞附着面积，可用电磁搅动装置使其悬浮。—般在250ml培养基中，微载体浓度为3mg/ml时，搅动速度每分钟50～70转效果最好。 3. 传代培养 （1）在连续进行微教体培养时，可以不必把细胞从微载体分离下来，可将带有细胞的微载体和新的微载体混合进行培养细胞能移动到新微载上。如果进行其它实验或需要分离细胞进行传代培养时，和常规培养相同；先用EDTA+胰蛋白本酶溶液作用使细胞脱离微载体表面。一般来说，比从玻璃表面分离细胞困难些，所以要预先用不含血清的培养液或缓冲液冲洗培养物，同时调节消化液的pH（pH7.8~8.0）和作用温度、时间。 （2）细胞脱离微载体后，可用自然沉降法，即在室温下静置5分钟，微载体将先自沉在底部，细胞大部份仍在上清中，然后离心上清即可得到细胞。如果需要分离程度较高时，需用孔径为100微米的尼龙网或不锈钢网过滤后，再离心滤过液，就可得到较纯净的细胞。  （3）在许多情况下，如进行显微镜观察、切片染色、冷冻储存等，可以使细胞脱离微载体，也可用带有细胞的微载体进行。用微载体培养哺乳动物细胞时，能在短时间内得到大量的活细胞，如果条件合适，在一周时间内，可获得比原来接种量多数十倍甚至近百倍的产量，并可节省培养基。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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