酵母细胞中质粒的加工实验一定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术
| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 酵母菌株 试剂、试剂盒 | 带选择标记的YRp或YCp质粒适当的限制性内切核酸酶相应选择标记突变的酵母菌质粒标记的选择培养基平板 仪器、耗材 | 培养皿 实验步骤 | 1）将目的基因亚克隆到带恰当的选择标记的YRp或YCp质粒上。 2)在基因内部的两个限制酶酶切位点上切割以产生缺口，在缺口的两侧各留下40〜200bP的同源区域，将得到的质粒片段进行凝胶纯化。缺口或切口尽可能靠近突变 位点。 3)如果用于致突变，通过PCR制备所需的致突变片段。如果是用来拯救或定位染色体等位基因，进行步骤4。 4)将1μg带缺口的质粒DNA和PCR产生的片段共同转化入带适当标记的酵母菌中。如果是用缺口修复来拯救基因组等位基因，就单独转化带缺口的质粒。 5)将转化子接种在专用于质粒标记选择平板上，鉴别成功修复的结果。对于恢复或定位染色体等位基因，利用质粒分离技术鉴别选择标记不稳定的转化子。如果突变正好位于缺口区域内，突变将会被修复的质粒携带。当突变位于缺口的附近时，其结果取决于交叉发生在什么部位。突变距离缺口区域越远，含有突变的质粒就会越少。 6)如果以PCR为基础的突变作为突变发生的方案，筛选具有突变表型的转化子。 注意事项 | 其他 | |
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发布于 ： 2018-08-06
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