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由歧化作用测定的 PDHC 总活性实验一基本方案
来自 : 蚂蚁淘
实验方法原理


实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
实验所需「试剂」具体见「其他」


0.98ml实验混合物


0.02ml酶样品


30℃培养15min后将样品放于冰中,然后加入0.2ml2mol/L羟胺。


室温放置10min后加入0.6mlFeCl3试剂


离心5min,以缓冲液取代酶样品为空白对照于546nm测量吸收值。


计算

注意事项
其他

试剂:


0.1mol/L磷酸钾,pH7.6


0.1mol/LMgCl2(MgCl2·6H2O,Mr=203.3;203mg溶于10ml水中)


0.1mol/L丙酮酸(丙酮酸钠,Mr=110.0;110mg溶于10ml水中)


0.01mol/L二磷酸硫胺(脱羧辅酶,Mr=460.8;46.1mg溶于10ml水中)


0.1mol/L二硫赤藓糖醇(DTE,Mr=154.2,或二硫苏糖醇、DTT,Mr=154.2;154mg溶于10ml水中)


0.01mol/L辅酶A(游离酸,Mr=767.5,CoA·Li3,Mr=785.4;23mg溶于3ml水中)


0.1mol/LNAD+(游离酸,Mr=663.4;663mg溶于10ml水中)


磷酸转乙酰酶(4000U/ml)


乳酸脱氢酶(10000U/ml)


2mol/L羟胺(等量的4 mol/L氯化羟胺,Mr=69.49和4mol/LKOH,Mr=56.11混合)


FeCl3试剂

100ml5%FeCl3(8.33gFeCl3·6H2O,Mr=270.3,用0.1mol/LHCl补充至100ml)

100ml12%TCA(三氯乙酸,Mr=163.4)

100ml3mol/LHCl(1:3的比例混合HCl和H2O)

将三种溶液混合

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