一、材料
无菌
1.解剖器械
2.含有或不含有血清的培养液(如M199)
3.非组织培养处理的滤膜培养皿(如CostarTranswell聚碳酸酯,#3423,Corning)
4.12孔的培养板(Corning)
非灭菌
1.已受精的鸡蛋,孵育8d
二、操作步骤
1.将滤膜培养皿放在多孔培养板的各个孔内,加入培养液直至达到滤膜底面水平(约1ml)。
2.将多孔培养板放入湿润的37°C恒温CO2培养箱中,以调整培养液的pH。
3.准备组织或切出整个胚胎器官(如8d鸡胚的股骨或胫骨;见方案12.2和方案12.7)。在一个纬度,组织厚度必须不超过1mm,最好更小(如8d胚的胫骨长度可能达5mm,但直径仅0.5~0.8mm。皮肤小块可为10mm2,但厚度仅为200μm。必须切成小块的组织不应大于1mm3,如肝或肾)。
4.在短时间内解剖标本(<1h),HBSS要充足。但是,较长时间解剖时应在以HEPES缓冲为pH7.4的HBSS中添加50%血清。
5.从培养箱中取出多孔板,小心地将组织转移到滤膜上。这一步最好用Pasteur吸管完成,可同时吸出随组织块转移出的液体,应小心不要刺破滤膜。在吸取前,先用培养液湿润吸管内壁,以防止吸取时组织块黏到吸管壁上。
6.检查培养液的水平,确认将组织浸湿,但没有完全浸没。然后,将培养板放回培养箱中。
7.2~4h后再次检查,确保培养液面保持在滤膜和组织块之上,但深度不足以使组织块浮起。
8.将组织培养1~3周,根据样本需要,每隔2~3d更换培养液1次。