肿瘤细胞培养实验一肿瘤细胞培养实验
| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | 培养液Hanks胰蛋白酶EDTA胶原酶 仪器、耗材 | 培养瓶离心管 实验步骤 | 一、成纤维细胞排除法 1. 机械刮除法 是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝），或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。 刮除程序为 （1）标记 镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位； （3）用Hanks液冲洗—两次，洗除被刮掉的细胞； （4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。 2. 反复贴壁法 （1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液； （2）取编号为A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中，置温箱中静止培养5~20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养； 当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。 3. 消化排除法 此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是 （1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化； （2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。 4. 胶原酶消化法 本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。 （1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视维细胞被除掉后，即终止消化； （2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。 5. 其它方法 有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025~1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心10分钟。在比重1.025~1.050层为成纤维细胞，在比重1.065~1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。 选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。 其他 | 一、取材 人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜超过24小时。 二、培养基 肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMI1640、DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤组织完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子，有的还需特异性生长因子（如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。 三、成纤维细胞的排除 成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法。  |
|---|
免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
版权声明 未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
发布于 ： 2018-08-06
阅读（63）
▍
相关分类
▍
相关文章
目的基因在真核系统中的表达及细胞内的定位实验资讯分析测试...
微生物检验中常见的生化反应_试验
经颅直流电刺激治疗脑卒中后失语研究进展_图文
PET的成像原理是什么?
DNA限制性酶切及凝胶电泳,实验原理及方法2资讯...
DNA复制时辨认复制起始点主要靠 A DNA聚合酶 B 拓扑异构酶 C 解链...
一抗/二抗该选谁?
Aimee'''s nonRadioactive EMSA Protocol Lambda 生物在线 Labo...
第3,4章 基因突变
从脐血来源多能祖细胞(CBMNCs)中分离并培养CD34+细胞实验
血清白蛋白溴甲酚绿法测定实验_实验⽅法_
从大规模裂解物中制备λ噬菌体颗粒实验_研内助_新浪博客
▍
相关问答
