材料

³²P-标记DNA酶I足迹探针

酚/氯仿（1:1;v/v)

乙醇（100%和75%;v/v)

试剂

聚乙烯醇（10%;w/v)

竞争DNA

缓冲液Z"(或缓冲液Ze）

DNA酶I(2,5mg/ml)

MgCl₂(10mmol/L)/CaCl₂(5mmol/L)

DNA酶I终止液

蛋白酶K(2.5mg/ml)

甲酰胺加样缓冲液

(配方，见“试剂的配制”，PP.131~138)

操作程序

1)1.5-ml塑料微量离心管置冰上预冷。加入DNA酶I终止液前可不必盖盖，（见步骤11,P.124)

2)按如下配方配制供所有反应用的组合探针DNA混合物：

1X探针DNA混合物（用于一次反应)

³²P-标记DNA探针                                          Xul

聚乙烯醇(10%)                                                                                       10ul

小牛胸腺DNA(1mg/ml);poly(dI-dC)、poly(dG-dC)、                               0.2~1ul

或poly(dA，dT)(10A_260nm单位；或不含竞争DNA(用于

纯的或近似纯的蛋白质)。对S-300柱组分（10ul),用

(0.2ul10A260nm单位poly(dI-dC)

H₂0                                                                                                          Zul

总体积                                                                                                        25ul

震荡，使探针DNA混合物彻底混匀。聚乙烯醇较粘稠，只有充分震荡才能使探针DNA溶液完全混合。
注：1.聚乙烯醇可能会促进因子与DNA的结合。它大概是作为“分子拥挤剂（molecularcroudingagent)"而起作用的，分子拥挤剂[”体积排阻剂（volumeexcluder)“]可加大分子如蛋白质和DNA的有效浓度（可把它想象成分子海绵，它只吸水和小离子而不吸大分子2.竞争DNA可用可不用，但分析粗制的蛋白质组分时，用竞争DNA常常是有益的。
注意，加入竞争DNA的时间可能是一个重要参数。一般，竞争DNA与探针混合物一起加人，如本方案中AP-1的足迹分析。不过，在某些情况下，加入蛋白质组分和探针混合后再在毎个管中分别加入竞争DNA,可能会更好座。加入竞争DNA的最适时间应由实验定。

3)于每个反应管中加入适量的缓冲液Z"十0.1mol/LKC1和缓冲液Z"+0.0mI/LKCl。
注：缓冲液Z"+蛋白质组分混合物的终体积应为25ul,混合物中KCl的终浓度应为0.1mol/L。例如，若用足迹法分析5ul含0.3mol/L的蛋白质组分，需加入10ul缓冲液Z"+0.0ml/LKCl和10ul缓冲液Z"+0.1mol/LKCl,以使盐的终浓度为0.1mol/LKC1。

4)将蛋白质组分直毕加于装有适量适当类型(0.0moI/LKCl或0.1mol/LKC1)的缓冲液Z"的f反应管中。

5)每个反应管中加入25ul探针DNA混合物，轻弹混合样品，置冰上孵育15min。同时，取一份2.5mg/mlDNA酶I储液解冻。

7)探针DNA和蛋白质组分孵育15min，临结束前，用冰预冷的水稀释DMA酶Ⅰ。然后颠倒并温和震荡，使之彻底混匀。
注：对于不含蛋白质的阴性对照反应，2ul1:2000倍稀释的DNA酶I可用于大多数DNA探针。而对于持定的DNA序列，DNA酶I的最适用量可因序列不同而异，对与不纯蛋白质的反应，由于可能存在DNAIII抑制剂如肌动蛋白单体，通常需要多加一点DNA酶I。粗制的蛋白质组分需要比正常多20~100倍的DNASI。部分纯化的蛋白质组分需要比正常多3~10倍的DMA酶I。纯的蛋白质组分不需要任何过量的DNA酶I。对每个待分析的蛋白质组分，均必须确定其最适的DNA酶I稀释度。

8）从冰上取下一份DNA探针和蛋白质组分样品，室温放置1min。
注；足迹分析时，所有必需的东西自动移液器、溶液、定时器、震荡器，DNA酶Ⅰ）均井然有序地摆放在--起是有益的。本操作程序进行得越顺当，足迹分析的结果将会越好(且重复性也越好)。

9)于反应管中加入50ul10mmol/LMgCl25mmol/LCaCl2溶液（室温)，轻弹混合。于室温放置1min。

10)于反应管中加入稀释的DNA酶I立刻轻弹混合。室温孵育lmin。
注：粗制蛋白质组分中的内源性核酸酶会改变DNA酶I的消化梯。因此，在对粗提物进行足迹分析时，应包括只含提取物而不加DNA酶Ⅰ的对照反应。

11)加90ulDNA酶I终止液。震荡混合。
注：通常，每个周期分析三个（或更多个）样品，下面的例子叙述了如何同时进行三个样品的分析。



12)(本步可任选）所有样品的足迹反应都完成后，加入10ul2.5mg/ml蛋白酶K,温和震荡混合，室温放置5min。这一步对蛋白质的粗提物很有用，但对纯的蛋白质则不是必需的。（本步可任选）

13)为制备电泳样品，可加200ul1:1酚/氯仿。震荡混合。离心5min。

14)上层转移至一新管。加800ul100%乙醇。颠倒混合，离心15min,沉淀核酸。

15)移去上清。加800ul75%乙醇。震荡混合。离心5min。

16)移去上清。用SpeedVac旋转浓缩器干燥沉淀物。

17)加9ul甲酰胺加样缓冲液，震荡溶解沉淀物。

18)煮沸3min,置冰上冷却。

19)离心0.5s,使溶液沉至管底。震荡混合。加样4ul于序列分折胶上。
注：为确定蛋白结合位点的位置，可将DNA酶I的酶切样品加在邻接于Maxam-Gilbert测序梯（sequencingladder)(由足迹探针制备）的泳道上。