实验材料 | 成年兔 试剂、试剂盒 | 乙醇重组腺病毒悬液凡士林 仪器、耗材 | 注射器 实验步骤 | 1.将成年实验兔放置于固定盒内。用浸取了温水的纱布反复擦拭使其耳内血管膨胀。 也可使用70%的乙醇。注意其静脉血管位于耳朵外缘,动脉游走于中心。 2.在5ml注射器上装上21G蝶形针头,然后吸入3ml腺病毒悬液,排除注射器内的空气。注射器内含有一定量的空气可使所有的溶液被注射入内。 3.扎入蝶形针头至兔耳静脉,并沿血管行进足够的深度以方便固定针头。开始以lml/min的速率注射腺病毒。在蝶形针头内留滞少量的溶液,注意一定不能注射人任何空气。 4.移出针头,然后迅速用纱布垫子压住扎口止血。 5.用凉水轻柔的清洗兔耳。并在兔耳上涂抹少量凡士林。观察兔子10~15min,如果兔看起来要昏睡,抚摸它保持其清醒。并立起或移动固定盒。 支持方案收获肝组织以分析转基因表达如果转基因编码的蛋白分泌至循环系统,那么其表达可经抽取动物血液并通过对血浆中的蛋白进行免疫杂交(如CPMB单元10.8)或酶学试验(如CPMB单元11.2)来验证。对于胞内或膜蛋白,肝组织收获后,转基因表达常应用免疫组化或免疫荧光(如CPMB第14章)、酶学试验(通常用冰冻切片或石蜡切片)、免疫杂交进行分析。可采用多重时间点来监控转基因表达的水平和持续时间。 1.注射腺病毒后,改善环境以侍养实验鼠或兔3~5d。用绳带将动物的脚固定至解剖器上,使其腹部朝上,并保持其四肢伸展。 2.用70%的乙醇润湿动物腹部的毛发。用镊子夹起其腹部的皮肤并沿中线切割,将其皮肤与腹壁分离。使用镊子提起其腹壁,继续沿中线切割,注意不要损伤其内脏。再在剖面的侧位进行一些切割,然后将其皮肤和腹壁翻折过来。 3.小心的切除肝脏,避免用镊子夹住肝脏组织。将其放置于灭菌的塑胶盘上。用两片干净的刀片将肝组织切碎。保持一把刀片与切割方向一致,然后拖动另一刀片来切割其邻近组织。 4.将肝组织样品按以下一种或多种方法进行保存。 a.石蜡切片。将切割的组织碎片(几毫米)置入福尔马林缓冲液中。包埋前固定过夜或更久。 b.新鲜冰冻切片。切碎的组织放人塑料模具中(对于小鼠肝脏,22mmX22mm大小的模具即可容纳一片大的或两片小的肝组织),然后用OCT复合物进行覆盖。在通风橱中放置一个较浅的容器,装入约1in(约2.5cm)的2-甲基丁醇以及于冰球或磨碎干冰。当其冷却后,将塑料模具放入容器中,使得2-甲基丁醇的冷却程度与OCT的相当。当完全冰冻后,将样品保存于一70°C。在低温恒温器中切割前先预冷至一20°C。 c.RNA纯化(Northernblot)或蛋白制样(immunoblots)。应从一些不同的肝叶中切取组织,并放人标记好的冻存管内。投入液氮中,并保存至一70°C。 |
---|