重组蛋白表达与纯化
| 提供商： | 生工生物工程 |
| 服务名称： | 重组蛋白表达与纯化 |
1.大肠杆菌（E.coli）表达系统
2.毕赤酵母（P.pastoris）表达系统
3.杆状病毒（Baculovirus）表达系统
4.哺乳动物细胞表达系统
价格与信息
一：大肠杆菌（E.coli）表达系统
步骤1.目标基因全基因合成：
步骤1.目标基因全基因合成：
1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。
2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。
3.合成设计好的基因序列。
交付内容：目的基因（在T载体或常规穿梭载体上）及测序报告。
时间：2周
步骤2.目标基因亚克隆：
1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。
2.将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。
3.测序验证构建质粒的准确性。
4.可提供表达载体（PET系列为主）
交付内容：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。
时间：2-3周
步骤3.E.coli表达菌株转化及筛选：
1.扩增并抽提构建好的表达质粒。
2.将表达质粒转化到高效的E.coli表达菌株中。
3.至少挑选5个阳性克隆于LB培养基中扩增并选择合适的条件，SDS-PAGE检测蛋白表达情况，筛?选出合适菌株。
4.可提供表达菌株：DH5α,Top10,JM115,BL21(DE3),BL21(DE3)pLys,XL1Blue等。
交付内容：重组质粒的表达菌株及表达检测报告。
时间：2-3周
步骤4.目标蛋白表达及纯化：
1.对时间，温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化，诱导表达目标蛋白。
2.摇瓶培养1L重组细菌，通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等层析方法纯化表达的重组蛋白。
3.利用蛋白酶去除不需要的纯化标签（Tag），再纯化获得所需的目标蛋白（可选，构建表达载体需加入合适的蛋白酶切位点）。
4.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
5.通过Western-blot验证目标蛋白正确性
交付内容：纯化好的目标蛋白5~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白，纯度最高可达95%以上。
时间：2-3周
说明：
1.如果没有获得目标蛋白，只收取一定的成本费。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
2.如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收100%相应费用。
3.因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们最终根据实际情况将给客户提供最少5mg，最多10mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。
1.如果没有获得目标蛋白，只收取一定的成本费。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
2.如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收100%相应费用。
3.因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们最终根据实际情况将给客户提供最少5mg，最多10mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。
4.我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证最终产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30%，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。
5.每次Western-blot检测最多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。
步骤5.目标蛋白的再加工及详细检测：
1.对生物学活性要求较高的纯化后蛋白产品进行复性研究。
2.内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。
3.通过HPLC，质谱等方法详细检测目标蛋白的质量
服务内容：
1：复性研究：利用多达20种不同复性缓冲液的体系，对目标蛋白进行小量复性试验提供复性后样品供客户检测，可
根据客户要求，按照其中一种样品的复性条件制备小量的复性蛋白，可提供具体的复性缓冲液配方及复性工艺。
2：除内毒素，
3：过滤除菌，
4：冻干，5：HPLC检测，
6：质谱检测，
7：N端测序。
交付内容：加工后的终产品及相关实验和检测报告。
时间：2-3周
步骤6.大规模制备：
按照小试工艺放大生产规模，制备客户需要的合格蛋白产品。
交付内容：合格的目标蛋白及服务报告。
时间：协商
二：毕赤酵母（P.pastoris）表达系统
步骤1.目标基因全基因合成：
1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。
2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。
3.合成设计好的基因序列。
交付内容：目的基因（在T载体或常规穿梭载体上）及测序报告。
时间：2-3周
步骤2.目标基因亚克隆：
1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。
2.将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。
3.测序验证构建质粒的准确性。
4.可提供表达载体：pPICZα和pPIC9K和pGAPCZα。
交付内容：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。
时间：2-3周
步骤3.P.pastoris表达菌株电转化：
1.酶切线性化表达质粒。
2.将表达质粒通过电转化到高效的P.pastoris表达菌株中。
3.通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆。
4.可提供表达菌株：X33，GS115，KM71和SMD1168。
交付内容：PCR阳性克隆及PCR结果报告
时间：2周
步骤4.P.pastoris表达菌株筛选：
1.将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增，然后换至BMMY培养基中，并加入甲醇诱导表达目标蛋白。
2.SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达
3.如果培养上清中检测不到表达，则通过将上清浓缩20倍作用再检测，或通过Western-blot方法检测目标蛋白表达（客户需要提供相关抗体）。
交付内容：阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。
时间：2周
步骤5.P.pastoris表达菌株表达优化：
1.挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选，并对其中表达最好菌株优化表达条件。
2.对挑选出来的单克隆菌株，优化培养及诱导条件（培养基，菌体密度，甲醇浓度，诱导时间等），提高目标蛋白的表达量。
交付内容：三个阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。。
时间：2周
步骤6.目标蛋白表达及纯化：
1.摇瓶培养1L重组酵母菌，诱导表达目标蛋白。
2.通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
3.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
4.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
交付内容：纯化好的目标蛋白1~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白，纯度最高可达90%以上。
时间：2-3周
说明：
1.如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
1.如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
2.如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收100%相应费用。
3.因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们最终根据实际情况将给客户提供最少1mg，最多10mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。
4.我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证最终产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30%，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。
5.每次Western-blot检测最多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。
步骤7.目标蛋白的再加工及详细检测：
1.内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。
2.通过HPLC，质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。
服务内容：
1：除内毒素，
1：除内毒素，
2：过滤除菌，
3：冻干，.
4：HPLC检测，
5：质谱检测，
6：N端测序。
交付内容：加工后的终产品及相关实验和检测报告。
时间：2周
步骤8.大规模制备：
按照小试工艺放大生产规模，制备客户需要的合格蛋白产品。
交付内容：合格的目标蛋白及服务报告。
时间：协商
三：杆状病毒（Baculovirus）表达系统
步骤1.目标基因全基因合成：
1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。
2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。
3.合成设计好的基因序列。
交付内容：目的基因（在T载体或常规穿梭载体上）及测序报告。
时间：2-3周
步骤2.目标基因亚克隆到pFastBac供体质粒：
1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。
2.将目标基因亚克隆到pFastBac供体载体上。
3.测序验证构建质粒的准确性。
4.通过中抽获得重组的质粒DNA
交付内容：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。
时间：2-3周
步骤3.制备重组杆状病毒BacmidDNA：
1.将重组的pFastBac供体质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态菌株中。
2.通过抗生素平板筛选出含有重组Bacmid的菌株。
3.抽提质粒获得重组的杆状病毒BacmidDNA。
交付内容：重组杆状病毒BacmidDNA，含重组质粒的DH10Bac菌株
时间：2周
步骤4.转染昆虫细胞Sf-9：
1.利用转染试剂将重组Bacmid质粒转入昆虫细胞Sf-9。
2.收集成熟的重组杆状病毒并检测病毒的滴度。
3.通过多次感染提高病毒的滴度，并扩增病毒数量。
4.通过SDS-PAGE和Western-blot检测目标蛋白表达情况。
交付内容：高滴度重组杆状病毒，病毒滴度及蛋白表达检测结果（如果转染不成功，则不收取费用。如果没有检测到目标蛋白表达，则只收取50%实验费用）。
时间：3周
步骤5.目标蛋白表达及纯化：
1.培养500ml昆虫细胞至对数期，然后加入适量病毒感染细胞并表达目标蛋白。
2.收集含有目标蛋白的部分（细胞或培养上清）。
3.通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
4.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
5.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
6.可提供表达细胞株：Sf-9，Sf-9Mimic，HighFive。
交付内容：纯化好的目标蛋白0.1~2mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白，纯度最高可达90%以上。
时间：2-3周
说明：
1.如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
1.如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
2.如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收100%相应费用。
3.因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们最终根据实际情况将给客户提供最少0.1mg，最多2mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。
4.我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证最终产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30%，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。
5.每次Western-blot检测最多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。
步骤6.目标蛋白的再加工及详细检测：
1内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。
2通过HPLC，质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。
服务内容：
1：除内毒素，
1：除内毒素，
2：过滤除菌，
3：冻干，
4：HPLC检测，
5：质谱检测，
6：N端测序。
交付内容：加工后的终产品及相关实验和检测报告。
时间：2-3周
步骤7.大规模制备：
按照小试工艺放大生产规模，制备客户需要的合格蛋白产品。
交付内容：合格的目标蛋白及服务报告。
时间：协商
四：哺乳动物细胞表达系统
步骤1.目标基因全基因合成：
1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。
2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。
3.合成设计好的基因序列。
交付内容：目的基因（在T载体或常规穿梭载体上）及测序报告。
时间：2-3周
步骤2.：目标基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体
1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。
2.将目标基因亚克隆到真核表达载体上。
3.测序验证构建质粒的准确性。
4.通过中抽获得重组的质粒DNA
交付内容：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。
时间：2周
步骤3.小量转染并通过Western-blot检测表达：
1.利用转染试剂将重组质粒转入合适的哺乳动物细胞中。
2.从转染后24到72小时，每12小时取样，通过SDS-PAGE和Western-blot检测目标蛋白表达情况。
3.可提供表达细胞株：293，293T，NIH/3T3，COS-7，CHO。
交付内容：目标蛋白表达结果。
时间：2周
说明：
1.如果转染不成功，则不收取费用。如果没有检测到目标蛋白表达，也要收取80%实验费用。
1.如果转染不成功，则不收取费用。如果没有检测到目标蛋白表达，也要收取80%实验费用。
2.每次Western-blot检测最多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或?是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。
步骤4.目标蛋白表达及纯化：
1.培养500ml哺乳动物细胞，然后将重组质粒转染到细胞中，通过瞬时表达产生目标蛋白。
2.收集含有目标蛋白的部分（细胞或培养上清）。
3.通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
4.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
5.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
交付内容：纯化好的目标蛋白及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白，纯度最高可达90%以上。
时间：3-4周
说明：
1.如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
1.如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
2.如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收100%相应费用
3.因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们最终根据实际情况将给客户提供最少0.1mg，最多2mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。
4.我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证最终产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30%，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。
5.每次Western-blot检测最多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。
步骤5.目标蛋白的再加工及详细检测：
1.内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。
2.通过HPLC，质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
服务内容：
1：除内毒素，
1：除内毒素，
2：过滤除菌，
3：冻干，
4：HPLC检测，
5：质谱检测，
6：N端测序。
交付内容：加工后的终产品及相关实验和检测报告。
时间：2周
步骤6.筛选稳定高表达细胞株：
1.将转染后的哺乳动物细胞团转到96孔细胞培养板内，然后加入含有MTX的培养基。
2.当细胞长到大约2/3孔时，取培养上清检测表达。
3.挑出高表达的细胞团用于下一轮筛选，并在下一次细胞培养基中提高MTX的浓度。
4.重复加压筛选过程，提高细胞株的表达量直到获得合适的稳定表达株。
5.通过SDS-PAGE电泳检测每步表达结果。
6.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
交付内容：稳定的高表达细胞株及筛选报告。
时间：6-8周
说明：因为每个重组蛋白的表达量受多种条件影响，我们并不能保证最终稳定株的表达量，但一般只有瞬时表达时表达量的1/10左右。
步骤7.大规模制备：
按照小试工艺放大生产规模，制备客户需要的合格蛋白产品。
交付内容：合格的目标蛋白及服务报告。
时间：协商
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发布于 ： 2018-03-20
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