1.根据样品类型，从下列方法中选一个作为步骤1进行操作。

(1)细胞样品

①单层培养的细胞

以用冰预冷的TBS将单层细胞洗涤2次，用刮棒把细胞刮入约0.5ml的TBS中，将细胞悬液转移到冰浴的离心管中，用1mlTBS冲洗培养皿，并入离心管中的细胞悬液。于4℃以1500g离心10分钟以收获细胞。用5~10倍体积经冰预冷的TBS重悬细胞并再度离心。用TE(pH8.0）重悬细胞，使细胞密度为5x10⁷细胞/ml，转移至一个三角烧瓶中（1ml细胞悬液用50ml烧瓶；2ml则用100ml烧瓶；余类推）。每毫升细胞悬液加入10ml抽提缓冲液，在37℃孵育1小时，随后进行步骤2。

抽提缓冲液：

10mmol/LTris-HCl，pH8.0

0.1mol/LEDTA，pH8.0

20μg/ml胰RNA酶

0.5%SDS

②悬浮生长的细胞

于4℃以1500g离心10分钟以收获细胞。用与原培养液等体积的经过冰预冷的TBS重悬细胞，再次离心收获细胞并重复洗涤步骤。用pH8.0的TE重悬细胞使密度为5x10⁷细胞/ml。将悬液转移至大小适当的烧瓶中，依前听述加入抽提缓冲液并孵育。

(2)组织标本

将刚切制的组织碎块放到盛有液氮的Waring绞切器的不锈钢杯中，以最高速度绞切至组织粉碎成为粉末。待液氮蒸发，将组织碎末一点一点地加入到盛有近10倍体积抽提缓冲液（如前）的烧杯中。使粉末分散在抽提缓冲液的表面，面后振摇烧杯使粉末浸没。待其完全分散于溶液中后，将该溶液转移至50ml离心管中，37℃孵育1小时。随后进行步骤2。

(3)血液标本

收集约20ml新鲜血液，加入装有3.5ml酸性柠檬酸葡萄糖溶液B(ACD)的试管中。这一抗凝剂优于EDTA，因为它在血液贮存过程中更能保存高分子量DNA。这些血液在制备DNA前可于0℃保存数天或于-70℃长期保存。配制ACD时，混合：

柠檬酸       0.48g

柠檬酸钠      1.32g

葡萄糖       1.47g

加水至100ml

用作抗凝剂时，每6ml新鲜血液中加入1mlACD。

新鲜血液（20ml）：以1300g离心15分钟，弃上层血浆，用巴斯德吸管将淡黄层小心移到另一管中并再次离心。淡黄层即为密度不均一的白细胞宽带。将经第二次离心的淡黄层重悬于15ml抽提缓冲液中，37℃孵育1小时，随后进行步骤2。

冻藏血液（20ml）：在室温水浴中融化，移至离心管中，用等体积PBS稀释；随后于室温以3500g离心15分钟并弃去上清液，其中含有已溶解的红细胞用15ml抽提缓冲液重悬沉淀物；37℃孵育1小时，随后进行步骤2。

2.蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，用玻棒温和地将酶混入黏稠的溶液中。

3.裂解细胞的悬液置于50℃水浴中3小时，不时悬动该黏稠溶液。

4.溶液冷却至室温，如有必要就将溶液倒入离心管。加等体积经0.5mol/LTris-HCl（pH8.0）平衡的酚，缓慢地来回颠倒离心管10分钟以轻轻地混合两相。如此时两相未能混合形成乳浊液，则将离心管置于旋转器上1小时，于室温以5000g离心15分钟，使两相分开。

5.大口径移液管（出口直径为0.3cm)将黏稠的水相移至一洁净的离心管中并用酚重复抽提2次。

6.分离高分子量DNA(约200kb)：第三次酚抽提后用全部水相于4℃对4L50mmol/LTris-HCl(pH8.0)、10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液透析4次，直至透析液的OD₂₇₀值小于0.05。让透析袋留有使样品体积增至1.5~2.0倍体积的空间。下转步骤7。

分离大小为100~150kb的DNA：第三次酚抽提后，将全部水相移至另一离心管中并加0.2倍体积的10mol/L乙酸铵。在室温下加2倍体积乙醇并转动离心管使溶液充分混合。DNA立即形成沉淀，通常可用制成U形并经封口的巴斯德吸管将沉淀从乙醇溶液中移出。而大部分污染的寡聚核糖核苷酸仍留在乙醇溶液中。如果DNA沉淀成为碎片，则在吊桶式转头中于室温以5000g离心5分钟收集DNA。用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，并按上述条件离心收集DNA。尽可能彻底地除去70%乙醇，于室温将DNA沉淀置于一个敞幵的管内，直至可见的痕量乙醇挥发殆尽。不要使DNA沉淀完全干燥，否则极难溶解。

大约按每5x10⁶细胞加1mlTE(pH8.0)。将管子放在摇床平台上慢慢摇动直至DNA完全溶解。这通常需要12~24小时。

7.测定DNA样品在260nm和280nm处的光吸收。A₂₆₀与A₂₈₀之比应大于1.75。低于此值则表明制备物中留有大量蛋白质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2~7。

8.计算DNA浓度，进行脉冲电场凝胶电泳或通过铺在1%琼脂糖支持层上的0.3%琼脂糖凝胶电泳分析小量样品。大于100kb的DNA，其迁移率应该比完整的λ噬菌体DNA的线性二聚体分子慢。将DNA贮存在4℃。