编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的检测、纯化和鉴定实验一从重组溶源菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性
| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 大肠杆菌Y1089 试剂、试剂盒 | 含有或不含10mmolLMgCl2的LB培养液1010pfumLλgtU重组噬菌体液1molLIPTG抽提缓冲液5mgmL溶于抽提缓冲液中的溶菌酶（保存于-20℃) 仪器、耗材 | 4molLNaCl32℃培养箱无菌牙签0.025μm圆形滤膜（MilliporeVS) 实验步骤 | 1)37℃在LB/麦芽糖/氨苄青霉素培养液中培养大肠杆菌Y1089hflA150生长至饱和。 2)用LB/MgCl2培养液将细菌悬液稀释100倍，取100μL用5μL1010pfu/mLλgtll重组噬菌体液感染，32℃温育。 3)用LB培养液将被感染的细菌悬液稀释1000倍。取100μL涂于LB/氨苄青霉素平板上，32℃温育过夜，每平板可获得约100个菌落。 4)试验单个菌落的温度敏感生长情况。用消毒牙签将各单菌落分别点种于2块LB/氨苄青霉素平板上。将其中1块置于42℃温育，另1块置于32℃温育。 能在32℃而不能在42℃生长的菌落为溶源菌，其出现频率应为10%〜80%。 5)在LB/氨苄青霉素培养液中将重组噬菌体溶源菌于32℃培养过夜。 6)取20μL过夜培养物接种于2mLLB/氨苄青霉素培养液中。于32℃在有良好通风的情况下培养。 7)当OD690=0.5(约3h)时，将温度调至44℃，培养20min。 8)加1mol/LIPTG至终浓度为10mmol/L,温度降低至37℃，继续培养1h。 9)取1mL经诱导的培养物在室温下离心45s。 10)将沉淀重悬于100μL抽提缓冲液中，迅速在干冰/乙醇中冻结。如果需要，于-70℃保存细胞悬液。 11)快速解冻细胞悬液。加5mg/mL溶菌酶至终浓度0.5mg/mL。在冰上放置15min。 12)加4mol/LNaCl至终浓度1mol/L，并彻底混匀。4℃在旋转式混合仪上温育15min 13)4℃离心30min，小心移出上清。 14)将上清置于0.025μm的圆盘滤膜上，对100mL抽提液4℃透析60min。然后在干冰/乙醇浴中迅速冻结，并保存于-70℃。 注意事项 | 其他 | |
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发布于 ： 2021-08-03
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