| 实验方法原理 | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | DNA库 试剂、试剂盒 | 氢氧化铵正丁醇TE缓冲液尿素上样缓冲液NaCl乙醇 仪器、耗材 | 荧光薄层层析板（VWR）紫外灯剃刀刀片小孔注射器能耐受极端温度的13ml离心管（Sarstedt）90℃水浴旋转混合器 实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1.寡核苷酸合成完毕后，去保护，从固相支持物上切下，然后将溶液冻干（在浓缩的氢氧化铵中），或者用10倍体积的正丁醇于-70℃放置＞1h将寡核苷酸沉淀出来。 2.制备一块变性的聚丙烯酰胺胶。 3.用100～200ul的水或缓冲液（如TE缓冲液，pH8.0）重新溶解冻干的或沉淀出的寡核苷酸，加入等体积的2×上样染料。上样前将样品加热到75℃热变性5min。每一2cm×2cm×1.6mm的孔中加入约20％的1umol合成的寡核苷酸进行电泳分离。 4.将胶放到塑料膜包裹的荧光薄层层析板上，在紫外灯的照射下用刀片切下寡核苷酸产物（通常为最暗的阴影条带）。 5.按如下步骤将寡核苷酸从胶条中洗脱出来： 5.1为了帮助寡核苷酸从丙烯酰胺基质中扩散出来，用力让胶条挤过小孔注射器以使之变为粉碎的颗粒。 5.2将碎胶放入一个能耐受极端温度的13ml的离心管中。 5.3每0.5ml的胶条（一般相当于1～2个加样孔的量）加入3ml的TE缓冲液，pH8.0，将样品于-80℃放置30min或直到样品冻成固体。 5.4将离心管放于热水浴中迅速解冻样品，然后于90℃浸泡5min。将样品放于旋转混合器上于室温洗脱DNA过夜。 6.用5mol/LNaCl储液将寡核苷酸洗脱液的盐浓度调整到0.3mol/L，然后加入3倍体积的乙醇以沉淀寡核苷酸库。于-20℃放置3h，然后于4℃以最高转速离心。冻干。用TE缓冲液（pH8.0，防止核酸酶污染或pH的剧变）重溶合成的库。
注意事项 | 其他 | 1.材料 DNA库 2.试剂 氢氧化铵 正丁醇 TE缓冲液，pH8.0 尿素上样缓冲液，2× 5mol/LNaCl 乙醇 3.耗材 荧光薄层层析板（VWR），塑料膜包裹 紫外灯 剃刀刀片 小孔注射器 能耐受极端温度的13ml离心管（Sarstedt） 90℃水浴 旋转混合器 |
