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用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质
来自 : 蚂蚁淘
实验方法原理同Chomczynski和Sacchi两人于1987年报道的RNA快速提取法一样,这种方法包括用含异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞。加入氯仿产生了第二相(有机相),DNA和蛋白质在有机相中被抽提,RNA则被留在上层水相中。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、材料

1.缓冲液和溶液

氯仿

乙醇
 
异丙醇

液氮

单相裂解试剂



磷酸缓冲盐溶液(PBS),冰冷

RNA沉淀液(1.2mol/LNaCl,0.8mol/L柠檬酸二钠盐·15H2O(不需要调pH)

乙酸钠(3mol/L,pH5.2)

2.细胞和组织

源细胞或组织

3.离心机和转头

SorvallH1000转头或与之相当的转头

SorvallSS-34转头或与之相当的转头

4.专用设备

测量260nm吸光度的比色杯

匀浆器(如Tekmar-Dohrmann的组织匀浆器和Brinkmann的polytron匀浆器)

研钵和研杵

带螺帽的聚乙烯管

水浴,预设定65℃

二、方法

1.准备分离RNA的细胞或组织样品

(1)组织

①解剖所要的组织,将其直接放入液氮中速冻。

②将100mg冰冻组织放液氮的研钵中,用研杵碾碎组织。在研磨过程中要不断添加液氮以保持组织冷冻。

③将粉末状的组织移入一个盛有1ml冰冷单相液的聚乙烯螺帽管中。

④于室温用polymm匀浆器高速匀浆组织15~30s。

(2)悬浮生长的哺乳动物细胞

①用台式离心机于室温以200~900g(SorvallH1000转头为1000~3000r/min)离心5~10min,收集细胞。

②吸出培养液,用1~2ml无菌冰冷的PBS重悬细胞沉淀。

③离心收集细胞,吸尽PBS,每106细胞加1ml单相裂解剂。

④于室温,用匀浆器高速匀浆细胞15~30s。

(3)单层生长的哺乳动物细胞

①吸出培养液,用5~10ml无菌冰冷的PBS洗涤细胞一次。

②吸出PBS,每个直径90mm培养皿中的培养细胞用1ml单相裂解剂裂解细胞(每个直径60mm培养皿加0.7ml单相裂解剂)。

③转细胞裂解液于一螺帽聚乙烯管中。

④于室温用匀浆器高速匀浆细胞裂解物15~30s。

2.于室温将细胞匀浆物温育5min使核蛋白复合物完全解离。

3.加入0.2ml氯仿于每毫升单相裂解剂中,通过剧烈摇动或用旋涡震荡器混匀样品。

4.于4℃以12000r/min(SorvallSS-34转头10000g)离心15min使混合物分为两相,将上层水相移至一个新的离心管中。

5.从水相中沉淀RNA:每1ml单相裂解剂,加入0.25倍体积的异丙醇和0.25倍体积的RNA沉淀液。充分混匀后,于室温放置10min。

6.于4℃以最大转速离心10min收集RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤沉淀两次,重复上述离心。用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇。将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟,让最后残存的痕量乙醇挥发殆尽。不要让RNA沉淀干透。

7.加50~100μlDEPC处理过的水。将RNA溶液贮存于-70℃。

加SDS至终浓度0.5%,然后加热至65℃有助于RNA沉淀的溶解。

8.估计RNA的浓度。

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