用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质
实验方法原理 | 同Chomczynski和Sacchi两人于1987年报道的RNA快速提取法一样,这种方法包括用含异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞。加入氯仿产生了第二相(有机相),DNA和蛋白质在有机相中被抽提,RNA则被留在上层水相中。 | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
实验材料 | 源细胞或组织 试剂、试剂盒 | 氯仿乙醇异丙醇液氮单相裂解试剂磷酸缓冲盐溶液RNA沉淀液乙酸钠 仪器、耗材 | SorvallH1000转头或与之相当的转头SorvallSS-34转头或与之相当的转头比色杯匀浆器研钵和研杵带螺帽的聚乙烯管水浴 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 氯仿 乙醇 异丙醇 液氮 单相裂解试剂 磷酸缓冲盐溶液(PBS),冰冷 RNA沉淀液(1.2mol/LNaCl,0.8mol/L柠檬酸二钠盐·15H2O(不需要调pH) 乙酸钠(3mol/L,pH5.2) 2.细胞和组织 源细胞或组织 3.离心机和转头 SorvallH1000转头或与之相当的转头 SorvallSS-34转头或与之相当的转头 4.专用设备 测量260nm吸光度的比色杯 匀浆器(如Tekmar-Dohrmann的组织匀浆器和Brinkmann的polytron匀浆器) 研钵和研杵 带螺帽的聚乙烯管 水浴,预设定65℃ 二、方法 1.准备分离RNA的细胞或组织样品 (1)组织 ①解剖所要的组织,将其直接放入液氮中速冻。 ②将100mg冰冻组织放液氮的研钵中,用研杵碾碎组织。在研磨过程中要不断添加液氮以保持组织冷冻。 ③将粉末状的组织移入一个盛有1ml冰冷单相液的聚乙烯螺帽管中。 ④于室温用polymm匀浆器高速匀浆组织15~30s。 (2)悬浮生长的哺乳动物细胞 ①用台式离心机于室温以200~900g(SorvallH1000转头为1000~3000r/min)离心5~10min,收集细胞。 ②吸出培养液,用1~2ml无菌冰冷的PBS重悬细胞沉淀。 ③离心收集细胞,吸尽PBS,每106细胞加1ml单相裂解剂。 ④于室温,用匀浆器高速匀浆细胞15~30s。 (3)单层生长的哺乳动物细胞 ①吸出培养液,用5~10ml无菌冰冷的PBS洗涤细胞一次。 ②吸出PBS,每个直径90mm培养皿中的培养细胞用1ml单相裂解剂裂解细胞(每个直径60mm培养皿加0.7ml单相裂解剂)。 ③转细胞裂解液于一螺帽聚乙烯管中。 ④于室温用匀浆器高速匀浆细胞裂解物15~30s。 2.于室温将细胞匀浆物温育5min使核蛋白复合物完全解离。 3.加入0.2ml氯仿于每毫升单相裂解剂中,通过剧烈摇动或用旋涡震荡器混匀样品。 4.于4℃以12000r/min(SorvallSS-34转头10000g)离心15min使混合物分为两相,将上层水相移至一个新的离心管中。 5.从水相中沉淀RNA:每1ml单相裂解剂,加入0.25倍体积的异丙醇和0.25倍体积的RNA沉淀液。充分混匀后,于室温放置10min。 6.于4℃以最大转速离心10min收集RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤沉淀两次,重复上述离心。用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇。将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟,让最后残存的痕量乙醇挥发殆尽。不要让RNA沉淀干透。 7.加50~100μlDEPC处理过的水。将RNA溶液贮存于-70℃。 加SDS至终浓度0.5%,然后加热至65℃有助于RNA沉淀的溶解。 8.估计RNA的浓度。 |
免责声明 本文仅代表作者个人观点,与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实,对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺,请读者仅作参考,并请自行核实相关内容。
版权声明 未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的,应该授权范围内使用,并注明“来源:蚂蚁淘”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
发布于 : 2021-08-20
阅读(183)
▍
相关分类
▍
相关文章
流式细胞仪用检测微球_微球
Simplified Arabidopsis Transformation Protocol 实验方法 丁 ...
DNA提取沉淀法,DNA extraction precipitation method,音标,读音...
ArcicZymes ArcicZymes 合作品牌 科技 ...
Hooke Laboratories 特约代理_化合物
十二指肠钩虫和美洲钩虫鉴定方法研究进展
Pentapharm_中国科研用品信息网科学实验用品信息平台
biospacific 公司新闻
PLASMID DNA PREPARATION.
毕赤酵母高效转化实验方案 实验方法
石英比色皿的光程是指什么意思?
明纬电源|开关电源|LED电源|直流电源|明纬电气科技有限公司|开关...