E.Z.N.A. Total RNA Kit I 步骤A． 真核细胞和组织自己需要的材料：β－巯基乙醇、70％乙醇（DEPC水配置）、除RNase的枪头和EP管。材料的最佳量想得到最佳的产量和好的Hibind RNA柱的纯化效果，选用正确的细胞和组织量是最重要的。Hibind RNA柱的最大处理量是可变的，根据细胞和组织的类型。最大的结合能力是100ug的RNA。TRK裂解缓冲液的最大裂解能力是1*107个细胞或30mg的组织。细胞的步骤1． 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞（≤1*107），使细胞团松散，轻轻弹EP管或者用枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。a) 使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β－巯基乙醇。b) 如果是单层的组织培养细胞（成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在细胞培养器里裂解细胞。完全吸去培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加700ul的TRK到T35细颈瓶或250px的培养皿中，更小的培养器加500ul的TRK。将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至1.5mlEP管中。c) 如果细胞是悬液培养，收集细胞（≤1,500rpm or 400*g）*5min，弃上清，加入TRK裂解液，漩涡振荡混匀，转移到1.5ml EP管中，进行步骤2。2． 匀浆化裂解产物“裂解和匀浆化样品”－第四页有详细的说明，如果细胞≤1*105，漩涡振荡1min。不完全使样品匀浆化会显著的减少RNA的产量还容易造成柱子堵塞。a) 用匀浆器30 s，使样品匀浆化。b) 用钝的针头的注射器（0.9mm直径），至少吹打5次是样品匀浆化。注射器要除RNase。3． 将匀浆后的裂解产物转移至Homogenization Spin Column中，离心，≥1,4000*g, 3min,室温。将离心收集的流出液转移到新的EP管中。转到总RNA分离中第4步。组织的步骤：1． 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞（≤30mg），使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β－巯基乙醇。500ulTRK裂解液最大裂解能力30mg，难破碎的组织大于20mg就用700ul的TRK裂解液。当组织量超出建议的最大量时，也不要超过40mg。组织样品匀浆化参照第四页选择一种方法只用，除非是使用液氮，2． 离心，≥1,5000*g, 5min, 室温。3． 转移上清至，Homogenization Spin Column中，离心，≥1,3000*g, 3min,室温。将离心收集的流出液转移到新的EP管中。总RNA分离：4． 在裂解产物中加入50％体积（250ul－350ul）的无水乙醇（96％－100％）混匀，漩涡振荡20s。5． 样品转移到Hibind RNA Mini column上，离心管的最大容量为750ul，加完乙醇后可能会形成沉淀。所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。室温离心，10,000*g,0.5-1min。弃去流出液（透过柱子流出到离心管里的液体）。6． 将柱子放在一个新的2ml收集管中，加上300ul RNA wash buffer I。室温离心，10,000*g, 0.5-1min。同样弃掉流出液。7． DNase I 消化（选择性）在我的实验中没有做这一步。8． 将柱子再放到一个新的2ml收集管中，加入400ul RNA wash buffer I, 室温离心，10,000*g, 30s，弃流出液。9． 将柱子放到2ml收集管中，加入500ul RNA wash buffer II（乙醇稀释过的），室温离心，10,000*g, 30s，弃流出液。注意：使用前RNA wash buffer II 必须要用无水乙醇稀释(48ml)，按照标签上的说明。10． 用500ul RNA wash buffer II洗涤一次柱子，同上一步骤一样。室温离心，10,000*g, 30s，弃流出液。然后在空收集管中，以最大转速离心柱子，≥12,000*g, 2min, 室温，使的HiBind 基质完全干燥。11． 转移柱子到一个新的1.5ml的Ep管中，（试剂盒中没有提供），加入50－100ul的DEPC水洗脱柱子（试剂盒中提供）。确保水直接加到了柱子的基质上。10,000*, 1min, 室温。如果RNA的总量大于30ug，可以进行二次洗脱。注意：可以选择性地，用大一点的体积洗脱RNA。如果进行二次洗脱，总RNA的量会增加，但是浓度会降低，因为80％以上的RNA会在第一次时被回收。在加柱子前将水加热到65℃并室温孵育柱子5min会增加产量。