2.1.11生物素化寡聚脱氧胸苷链亲和素磁珠纯化带 Poly(A)+RNA一生物素化寡聚脱氧胸苷链亲和素磁珠纯化带 Poly(A)+RNA
试剂、试剂盒 | GTC抽提缓冲液稀释缓冲液β-巯基乙醇无RNase水20XSSC0.5XSSC1XPBS。 仪器、耗材 | 亲和素-磁珠(SA-PMP)生物素标记的oligo(dT)探针磁架75℃水浴50ml无菌Corex离心管15ml螺旋盖锥形离心管TissuemizerDM或其他同类匀浆器BeckmanJ2-21离心机或其他类似设备 实验步骤 | 一材料与设备 1)亲和素-磁珠(SA-PMP) 2)GTC抽提缓冲液:4moL/I,异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸钠,pH:7.1 3)生物素标记的oligo(dT)探针(50pmol/ul) 4)稀释缓冲液:6XSSC,lmmol/LTris-HCl,PH7.4,lOmmoL/LEDTA,0.25%SDS 5)β-巯基乙醇(48.7%) 6)无RNase水 7)20XSSC:67.7gNaCl和44.lg柠檬酸钠溶于400ml去离子水中,用NaOH调pH至7.2,加水至500ml体积,用0.1%DEPC处理过夜,高压灭菌 8)0.5XSSC: 20XSSC用无RNase水稀释而成 9)1XPBS 10)磁架 11)75℃水浴 12)50ml无菌Corex离心管 13)15ml螺旋盖锥形离心管 14)TissuemizerDM或其他同类匀浆器 15)BeckmanJ2-21离心机或其他类似设备 二操作方法 以重量小于0.125的组织中mRNA的纯化为例,大量组织和细胞中mRNA的纯化可参阅相关产品说明书。 1)从冰箱中取出GTC抽提液、生物素标记的oligo(dT)探针、无RNA酶的水及0.5XSSC,平衡至室温并预热稀释液至70℃ 2)在50ml无菌螺旋盖锥形离心管屮,首先加入lml抽提液(抽提/BME缓冲液)然后再向其中加人41ulβ-巯基乙醇(48.7%),保证β-巯基乙醇的终浓度为2%。井将装有缓冲液的管子称重并记录。 3)尽可能快地取得所需量的组织并放人到装有抽提/BME缓冲液的管中,使用小匀浆器髙速匀浆组织至无可见组织块。如果无匀浆器,则可将组织快速切碎,液氮冷冻,在装有液氮的研钵中捣碎研磨。将液氮和组织转移到无菌的50ml螺旋盖锥形管中,液氮挥发后,立即加人抽提/BME缓冲液,使之完全混合 4)将含有组织及抽提/BME缓冲液的骨子称重,减去第2)步中的管重并计算组织块的大小。 5)参考图2.1,根椐第4)步计算的组织块大小决定生物素标记的oligo(dT)探针用量和亲和素-磁珠(SA-PMP)用量。 6)将2ml预热稀释缓冲液加到无菌管中,加入41ulβ-巯基乙醇(48.7%),终浓度为1%。将此溶液加至匀浆液中.完全混合。再加入第5步确定的探针,晃动以充分混合,并在70°C温育5min 7)转移匀浆液至一清洁无菌的15mlCorex管屮,室温12000g离心1Omim 8)离心时,轻轻晃动使SA-PMP完仝悬浮,将所需量的磁珠转移到一无菌的50ml螺旋盖锥形管中,将此管放置在磁架上。水平放置磁架至磁珠全部聚集在管的一侧。倾斜管子使溶液不流经磁珠表面.小心倒掉储存液 9)用等体积的0.5XSSC悬SA-PMP,用磁架捕捉,按第8步倒掉SSC溶液。重复洗涤两次后,将SA-PMP重悬在初始体积0.5XSSC中。 10)勻浆液离心完成后,小心取出上清,避免吸取沉淀。将已澄清的匀浆液加人含洗涤好的SAPMP的管中,翻转混合 11)将匀浆液及SA-PMP室温孵育用磁架捕捉SAPMP至勻浆液淸澈.按前述方法小心倾去上清液。用一无菌管收集上清液,放在冰上保存直至能肯定mRNA已获得令人满意的结合和洗脱 12)于lml0.5XSSC中宙悬磁珠,再转移到2ml试管中.用磁架捕获磁珠,小心倾去SSC,重复洗涤两遍。最后一次洗后要尽可能多地去除SSC而不搅动SA-PMP。 13)用0.5mL无核酶的水洗脱mRNA,轻振试管重悬SA〜PMP。 14)用磁架捕捉SA-PMP,将洗脱的RNA转移到无蔺小离心管中。用无菌水重悬磁珠,保存在冰中直至mRNA产量和纯度被确定。 15)向洗脱液中加入0.1倍体积的NaAc(用于CDNA克隆)或KAc(用于体外翻译)和1倍体积的异丙醇,放置过夜。 16)于12000g离心lOmin,用lml70?%乙醇重悬RNA沉淀T再离心 17)真空干燥沉淀15min用无RNase的去离子水溶解沉淀。 注意事项 | |
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发布于 : 2021-07-18
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