一材料与设备

1)0.75mol/L柠檬酸钠，pH7.0(含柠檬酸）,用0.1%DEPC处理并高压灭菌

2)10%(m/V)N-月桂肌氨酸(N-lauroylsarcosine)

3)硫氰酸胍缓冲液：用293ml无菌去离子水，17.6ml0.75mol/L柠檬酸钠,26.4m丨10%N-十二醇肌氨酸钠，在厂家药瓶内于溶解250g硫氰酸胍(不用称重)

4)抽提缓冲液：每5ml硫氰酸胍缓冲液加36ul巯基乙醇。若被提取的组织中含多聚苯酚，抽提缓冲液中则可加入聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinypoiypyrrolidone)(20%，m/m)

5)氯仿：异戊醇49:1(V/V)

6)2mol/L乙酸钠，加乙酸至pH4.0

7)酸性苯酚:500g晶体苯酚溶于500mli离子水中，50ml每份于-20℃保存，4℃可保存一个月

8)异内醇

9)70%和100%乙醇

10)2mol/L乙酸钾，加冰乙酸至pH4.8

11)10mol/LLiCl

12)TNE缓冲液：10mmol/LTris-HCl,PH7.5,室温，15mmol/L,NaCl，1mmol/LEDTA

13)TE缓冲液:l0mmol/LTris-HCLPH7.51mmol/LTEDTA

14)研钵和研杵

15)液氮

16)离心机

17)玻璃Pasteur吸量管，200℃干烤至少3h


二操作方法

1)在液氮中将0.4g组织研磨为细粉末，勿让组织解冻

2)在研磨过程中，加入3.5ml抽提缓冲液，充分研磨。将匀浆转移到一个10ml聚丙烯管=用1ml抽提缓冲液冲洗研杵和研钵，然后移至聚丙烯管中。

3)23000g，4℃,离心20mim

4)用烤过的玻璃吸量管将hS悬浮液移入l0ml聚丙烯管。

5)加0.4ml2mol/L乙酸钠，混匀。加4ml苯酚，混勻。加0.8ml氯仿：异戊醇，混匀。

6)聚丙烯管置于冰上15min

7)离心，方法如步骤3)

8)用烤过的玻璃吸量管将上层悬浮液移入30ml聚丙烯管，加入同样容积的2mol/L乙酸钾，混匀。

9)聚丙烯管置于冰上至少30min

10)44000g，4℃离心20min。

11)将上清液移入15ml聚内烯管，加0.6〜1倍体积的100%的预冷异丙醇，混匀，-20℃放置45min

12)以27OOOg，于4℃离心20min

13)轻轻倒出上清液，用Iml70¾乙醇洗涤沉淀，如步骤12离心3mim尽可能将乙醇倒净。

14)加人400ulDEPC水溶解沉淀，移至1.5ml管中。

15)加100ul10mol/LLiCl,放置至少2h。

16)12000g，离心20min

17)用1ml70%乙醇洗涤沉淀两次

18)加入200ulTNE重悬沉淀，再加500ul100%乙醇，-20°C放置至少15min。

19)如步骤16离心5mim。

20)用lml70%乙醇洗涤沉淀两次。

21)加入200〜400ulTE重悬沉淀。

22)将每个样本稀释30〜50倍，在230mn、260mn、280nm测量光吸收值。