mRNA的提取及纯化实验一磁珠法
实验材料 | mRNA 试剂、试剂盒 | mRNA分离试剂盒异丙醇NaAC 仪器、耗材 | 仪器水浴离心机取液器分光光度计 实验步骤 | 一、生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火 1. 在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中,加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。 2. 65℃加热10min。 3. 加入2μl生物素标记的Oligo(dT)探针和12μl的20×SSC于RNA中轻轻混匀,室温放置,逐渐冷却平衡至室温,此步操作一般需10min。 二、亲和素顺磁磁珠(SA-PMPS)的冲洗 1. 将SA-PMPS轻晃开后,放入磁性分离架中,使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒),小心去除上清(不用离心方法)用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS,用磁性分离架集中磁珠,去除上清,漂洗3次。 2. 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5×SSC中。杂交体的生成及漂洗。 3. 将上步“3”中褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针,全部加到上步“5”管中,轻轻混匀,室温放置10min。每隔2分钟轻轻混匀一次。 4. 用磁性分离架捕获磁珠,吸弃上清。 5. 用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS,用磁性分离架集中磁珠,吸弃上清,漂洗4次。 三、洗涤收集mRNA 1. 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中。 2. 用磁性分离架捕获磁珠,将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次,吸取水相,两次水相合并(约0.25ml) 3. 在洗脱液中加入0.1体积的NaAC,1体积的异丙醇,-20℃沉淀过夜,12000g离心10min,75%乙醇洗沉淀,真空干燥。 4. 提取mRNA质量的分光光度计检测,将所提mRAN分别在260,280nm比色,要求A. OD260%/OD280%不小于2.0及40μg所提样品在OD260%的值为1。 5. 提取mRNA质量的电泳检测,在1%的变性胶上,EB染色后,mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色,1.5-2Kb间着色较强。 |
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发布于 : 2021-07-21
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