mRNA的提取及纯化实验一亲和柱层析法
| 实验方法原理 | 该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附，而在低盐下，碱基配对能力破坏，吸附解除，而其他成分的RNA则不具该特性，因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时，mRNA被挂在柱上，而其他RNA则随高盐溶液流出；当用低盐洗脱液洗柱时，mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | mRNA 试剂、试剂盒 | 十二烷基肌氨酸钠EDTANaClTris-HCl洗脱液SDS 实验步骤 | 1. DEPC处理层析柱。 2. 0.1MNaOH处理Oliga(dT）－纤维素。 3. 用1×上样液洗柱至pH<8.0。 4. 无菌水溶解RNA，65℃温浴5分钟后，迅速冷却至室温，加等体积2×上样液，上样，分部收集。 5. 1倍体积1×上样液洗柱，分部收集。 6. OD260沉淀收集液，确定收集液的该值是否接近0，如该值仍很大，则上样液继续洗柱，直至该值接近0。 7. 2~3倍柱床体积的洗脱液，洗柱，分部收集。 8. 测定各收集管的OD260，将有吸光值的各管合并。 9. 在洗脱液中加入0.1体积的NaAC，1体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，12000g离心10min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。 10. 提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260，280nm比色，要求A. OD260%/OD280%不小于2.0及40μg所提样品在OD260%的值为1。 11. 提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色，1.5-2Kb间着色较强。 |
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发布于 ： 2021-07-20
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