聚合酶链反应构建重组DNA一基本方案
| 实验材料 | DNA 试剂、试剂盒 | TE无水乙醇DNA聚合酶CTP 仪器、耗材 | 电泳仪离心机PCR仪 实验步骤 | 1. 制备模板DNA，如DNA不是经氯化铯梯度纯化的，100℃煮沸10min以灭活核酸酶。  图一、用PCR反应引入单一的酶切微点和产生符合读码框架的融合蛋白。 3. 建立标准的扩增反应，以矿物油覆盖表面，在以下条件下进行20~25轮扩增循环：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸3min，最后一个循环在72℃延伸10min尽可能使扩增产物完整。  图二、序贯PCR法构建重组DNA分子，引物1b与基因2同源区域；引物1c有与基因1同源区域 4. 取少量反应混合物（4~8μl），用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效果。 5. 吸去矿物油上层，用氯仿抽提1次除去残存的矿物油，用饱和酚抽提1次，然后用无水乙醇沉淀DNA。  图三、用反向PCR插入酶切位点 8. 对于通过平端连接进行的克隆：用DNA聚合酶I（或klenow酶）修平扩增片段的3‘末端。 9. 对于通过粘端连接进行的克隆：在20μl体积用合适的酶消化一半PCR只产物，用过量的酶消化数小时。 10. 用合适的末端互补的酶在20μl体积内消化0.2~2μg载体DNA，用CIP去瞵酸化，以阻止载体自连。 11. 用普通琼脂糖或低融点琼脂溏电泳分离线性化的载体。 12. 用玻璃珠、电洗脱、或酚抽法回收线状的载体。 13. 连接PCR片段和线状载体。 14. 取部分连接产物转化大杨杆菌，从转化体集中以小量制备法提取质粒DNA。 15. 用合适的酶消化转化体的质粒DNA，以琼脂糖凝胶电泳分析以确证片段的插人。 16. 测定质粒DNA中扩增片段的序列，检查有无突变，或者用生物化学或遗传学方面的功能分祈筛选转化体。 |
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发布于 ： 2021-08-05
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