用 T7 噬菌体 DNA 聚合酶进行双脱氧测序反应实验
试剂、试剂盒 | 去离子蒸馏水二硫苏糖醇dNTP和ddNTP标记混合液和ddNTP延伸终止混合液甲酰胺上样缓冲液测序酶稀释缓冲液测序酶反应缓冲液含MgCl2测序酶酵母无机焦磷酸酶寡核苷酸引物模板DNA放射性化合物 仪器、耗材 | 离心机和转头微量离心管或微量滴定板 实验步骤 | 材料 缓充液和溶液 去离子蒸馏水(冰预冷) 二硫苏糖醇(DTT)(100mmol/L) dNTP和ddNTP,dNTP(0.5mmol/L)和ddNTP(0.5mmol/L)储液 5X标记混合液和ddNTP延伸/终止混合液(ddCTP、ddTTP、ddATP、ddGTP) 这些反应混合液可按表12-5给出的溶液体积混合配制。 甲酰胺上样缓冲液 测序酶稀释缓冲液 10mmol/LTris-Cl(pH7.5) 5mmol/LDTT 0.5mg/ml牛血淸白蛋白 -20°C储存 5X测序酶反应缓冲液,含MgCl2 200mmol/LTris-Cl(pH7.5) 100mmol/L 125mmol/LNaCl -20°C储存 5x测序酶反应缓冲液,含MnCl2 200mmol/LTris-Cl(pH7.5) 25mmol/LMnCl2 125mmol/LNaCl -20°C贮存 在测序酶反应缓冲液中含有Mn2+可以增加测序酶利用ddNTP的效率,即使有Mg2+存在也是如此(TaborandRichardsonlSS%)。结果使在测序反应中靠近引物部分产生有效终止,进而增强靠近寡核苷酸引物处条带的强度,或者当使用dITP碱基类似物时,有利于消除富含GC区序列的影响。 为了使用Mn2+,可在加入测序之前在标记反应中加入1ul含有MnCl2的5x测序酶反应缓冲掖(Fulleretal.1996)或者加入0.01体积的1mol/LMnCI2至双脱氧-dNTP廷伸/终止混合液中(Kristmseetal.1990)。含锰的缓冲液如呈淡黄色或产生黄褐色沉淀将不能使用。 TE(pH7.6) 酶和缓冲液 测序酶(2.0版) 测序酶由生产商提供,浓度为13u/ul(约lmg/ml)。-20°C储存(不要使用无霜冰箱)。 酵母无机焦磷酸酶 可选用,请参见步驟6。厂商(USB/AmershamLifeScience公司)提供的酶浓度为5u/ml,它可催化焦磷酸水解为2分子正磷酸盐。 焦磷酸酶与测序酶以1:3的比例混合,最好采用等体积混合两种酶,并用6倍体积的酶稀释缓冲液稀释该混合钧。测序酶的工作浓度为1.6u/ul,同时加入足量焦磷酸酶以防止焦磷酸的积累,每个测序反应需2ul稀释的酶混合液。 核酸和寡梭苷酸 寡核苷酸引物 浓度为0.5pmol/ul(约3.3ng/ul),溶于水或TE(pH7.6)中。 请参见信息栏"DNA测序寡核苷酸引物储液制备”。对于一些结合于靶区域上游载体序列的通用引物,可参见第8章信息栏“通用引物”。 模板DNA(lug/ul)溶于TE(PH7.6)中 每一套测序反应需要1ug单链DNA或2.0ug变性双链质粒DNA。双链线性DNA需要变性,并使它与引物复性。即先把天然模板DNA与过量的引物混合,在沸水浴中加热约2min,然后把试管插入冰水浴中。不要让混合液溫度回升,立刻使用。 小规模制备M13噬菌体重组于单链DNA的浓度一般在0.05-0.5ug/ml的范围内。这取决于特定噬菌体的生长速度。在正常测序反应条件下,模板DNA是过量的。因而毎次测序反应中模板量上的微小变化并不影响测序结果的质量。可参见本方案末尾的表12-6。 放射性化合物 [a-35S]dATF(1000Ci/mmol,10mCi/ml)或 [a-33P]dATP(1000~3000Ci/mml,约20mCi/ml)或 [a-32P]dATP(1000Ci/mmol,10mCi/ml) 若不用放射性标记的[32P]dATP作为内标记,也可以用5"端以35P标记的寡核苷酸引物进行测序反应,此时可用2ul放射性标记引物(约5X105cpm;约0.5ng)和2ul水代替反应中的未标记引物(步骤1)和放射性标记dATP(步骤7),其他步骤相同。一般用多核苷酸激酶催化ATP的[γ-32P]转移至寡核苷酸5‘末端。详细步骤见第10章的方案2。 离心机和转头 离心转头或用于0.5ml微量离心管的衔接头,以及甩平式转头和微量滴定板架(如Sorvall公司产品),聚苯乙烯泡沬或橡胶衬垫。 专用设备 微量离心管(0.5ml)或微量滴定板(柔韧,耐热,每孔容量约为300ul的U型底96孔板) 参见信息栏“微量滴定板”。 可加热到37°C和65°C的水浴或加热板。 方法 重要:当测序的双链质粒DNA已经变性,并已与引物退火(方案2),可以忽略本方案的前两步.直接从步骤3开始。 1.在0.5ml微量离心管或微量滴定板孔中加入: 单链模板DNA(1ug/ul) 1ul 寡核苷敢引物(约1ng/ul) 3ul 5X测序酶反应缓冲液 2ul 含MgCl2或MnCl2 水 至终体积10ul 2.封闭试管,在65°C温育2min,然后取出离心管,使之在3~5min内冷却至室温。 有些实验人员喜欢用小加热板或装水的烧杯,使该退火反应在30min的过程中缓慢冷却。我们实验中发现,这两种方法的实验结果相同。 3.在引物和模板降温时,融化5X标记混合液、ddNTP延伸/终止混合液和放射性标记的dATP,融化后置于冰上。若有必要,退火的棋板和引物可在-20°C下保藏几个月。 4.取2.5ul每种ddNTP延伸/终止反应混合液加至用彩色标记或用字母C、T、A、G标记的各个0.5ml微量心管或微量滴定板各孔中。 当液滴挂在离心管壁或微量滴定板孔壁时.应离心使之沉入底部。 5.将5x标记混合液用冰预冷的水稀释5倍,每种测序反应需要2ul稀释的标记混合液。 6.用冰预冷的测序酶稀释缓冲液稀释测序酶,如材料中所述可加,也可不加酵母焦磷酸酶。 毎种模板测序需要测序酶(含3单位)。测序酶要始终放置于冰上。 7.为进行标记反应,在步骤2的10ul退火反应液中加入如下溶液: 稀释的标记混合液(来自步骤5) 2ul 0.1mol/L二硫苏糖醇 1ul [a-33P]dATP,[a-32P]dATP或[a-35S]dATP 0.5ul 稀释的测序酶(约1.6u/ul) 2.0ul 轻轻拍打离心管壁或滴定板以便混匀反应物,然后在20°C孵育2~5min。 稀释的测序时应保存在冰上,不要使其温度升至室温。供应商提供的浓缩酶应贮存于-20°C,如果置于冰上几小时酶将失活。 8.在标记反应将近完成时,应于37°C预热离心管或微量滴定板以便进行终止反应。这—步很重要。然后,转移3.5ul标记反应液到已经预热的、做好标记的、已加入适量的双脱氧混合液(上述步骤4)的微量离心管壁或微量滴定板孔壁上。 9.在室温下,将微量离心管放入微量离心机中(用适合于0.5ml离心管的转头或衔接头,或将其置于去盖的1.5ml离心管中),或将微量滴定板置于有适当衔接头的离心机中,以2000r/min离心C、T、A、G管或板几秒钟,混匀混合液。然后立即将反应物置于37°C加热板或水浴中3~5min。 10.加4ul甲酰胺上样缓冲液终止反应。 11.这些反应物在-20°C时可最多保存5天,也可以用变性凝胶电泳直接分析(见方案8、9、或10、11和12)。热变性后(100°C,2min),在冰上快速冷却。取C、T、A和G反应物各3ul加入测序凝胶的各孔中。 |
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发布于 : 2021-08-13
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