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用 T7 噬菌体 DNA 聚合酶进行双脱氧测序反应实验
来自 : 蚂蚁淘
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
材料

缓充液和溶液
去离子蒸馏水(冰预冷)

二硫苏糖醇(DTT)(100mmol/L)

dNTP和ddNTP,dNTP(0.5mmol/L)和ddNTP(0.5mmol/L)储液

5X标记混合液和ddNTP延伸/终止混合液(ddCTP、ddTTP、ddATP、ddGTP)
这些反应混合液可按表12-5给出的溶液体积混合配制。

甲酰胺上样缓冲液

测序酶稀释缓冲液

10mmol/LTris-Cl(pH7.5)
5mmol/LDTT
0.5mg/ml牛血淸白蛋白
-20°C储存

5X测序酶反应缓冲液,含MgCl2

200mmol/LTris-Cl(pH7.5)
100mmol/L
125mmol/LNaCl
-20°C储存



5x测序酶反应缓冲液,含MnCl2

200mmol/LTris-Cl(pH7.5)
25mmol/LMnCl2
125mmol/LNaCl
-20°C贮存
在测序酶反应缓冲液中含有Mn2+可以增加测序酶利用ddNTP的效率,即使有Mg2+存在也是如此(TaborandRichardsonlSS%)。结果使在测序反应中靠近引物部分产生有效终止,进而增强靠近寡核苷酸引物处条带的强度,或者当使用dITP碱基类似物时,有利于消除富含GC区序列的影响。
为了使用Mn2+,可在加入测序之前在标记反应中加入1ul含有MnCl2的5x测序酶反应缓冲掖(Fulleretal.1996)或者加入0.01体积的1mol/LMnCI2至双脱氧-dNTP廷伸/终止混合液中(Kristmseetal.1990)。含锰的缓冲液如呈淡黄色或产生黄褐色沉淀将不能使用。

TE(pH7.6)

酶和缓冲液

测序酶(2.0版)
测序酶由生产商提供,浓度为13u/ul(约lmg/ml)。-20°C储存(不要使用无霜冰箱)。

酵母无机焦磷酸酶
可选用,请参见步驟6。厂商(USB/AmershamLifeScience公司)提供的酶浓度为5u/ml,它可催化焦磷酸水解为2分子正磷酸盐。
焦磷酸酶与测序酶以1:3的比例混合,最好采用等体积混合两种酶,并用6倍体积的酶稀释缓冲液稀释该混合钧。测序酶的工作浓度为1.6u/ul,同时加入足量焦磷酸酶以防止焦磷酸的积累,每个测序反应需2ul稀释的酶混合液。

核酸和寡梭苷酸

寡核苷酸引物
浓度为0.5pmol/ul(约3.3ng/ul),溶于水或TE(pH7.6)中。
请参见信息栏"DNA测序寡核苷酸引物储液制备”。对于一些结合于靶区域上游载体序列的通用引物,可参见第8章信息栏“通用引物”。

模板DNA(lug/ul)溶于TE(PH7.6)中
每一套测序反应需要1ug单链DNA或2.0ug变性双链质粒DNA。双链线性DNA需要变性,并使它与引物复性。即先把天然模板DNA与过量的引物混合,在沸水浴中加热约2min,然后把试管插入冰水浴中。不要让混合液溫度回升,立刻使用。
小规模制备M13噬菌体重组于单链DNA的浓度一般在0.05-0.5ug/ml的范围内。这取决于特定噬菌体的生长速度。在正常测序反应条件下,模板DNA是过量的。因而毎次测序反应中模板量上的微小变化并不影响测序结果的质量。可参见本方案末尾的表12-6。

放射性化合物

[a-35S]dATF(1000Ci/mmol,10mCi/ml)或
[a-33P]dATP(1000~3000Ci/mml,约20mCi/ml)或
[a-32P]dATP(1000Ci/mmol,10mCi/ml)
若不用放射性标记的[32P]dATP作为内标记,也可以用5"端以35P标记的寡核苷酸引物进行测序反应,此时可用2ul放射性标记引物(约5X105cpm;约0.5ng)和2ul水代替反应中的未标记引物(步骤1)和放射性标记dATP(步骤7),其他步骤相同。一般用多核苷酸激酶催化ATP的[γ-32P]转移至寡核苷酸5‘末端。详细步骤见第10章的方案2。

离心机和转头

离心转头或用于0.5ml微量离心管的衔接头,以及甩平式转头和微量滴定板架(如Sorvall公司产品),聚苯乙烯泡沬或橡胶衬垫。

专用设备

微量离心管(0.5ml)或微量滴定板(柔韧,耐热,每孔容量约为300ul的U型底96孔板)
参见信息栏“微量滴定板”。

可加热到37°C和65°C的水浴或加热板。

方法

重要:当测序的双链质粒DNA已经变性,并已与引物退火(方案2),可以忽略本方案的前两步.直接从步骤3开始。

1.在0.5ml微量离心管或微量滴定板孔中加入:

单链模板DNA(1ug/ul)                       1ul
寡核苷敢引物(约1ng/ul)                   3ul
5X测序酶反应缓冲液                          2ul
含MgCl2或MnCl2
水                                    至终体积10ul

2.封闭试管,在65°C温育2min,然后取出离心管,使之在3~5min内冷却至室温。
有些实验人员喜欢用小加热板或装水的烧杯,使该退火反应在30min的过程中缓慢冷却。我们实验中发现,这两种方法的实验结果相同。

3.在引物和模板降温时,融化5X标记混合液、ddNTP延伸/终止混合液和放射性标记的dATP,融化后置于冰上。若有必要,退火的棋板和引物可在-20°C下保藏几个月。

4.取2.5ul每种ddNTP延伸/终止反应混合液加至用彩色标记或用字母C、T、A、G标记的各个0.5ml微量心管或微量滴定板各孔中。
当液滴挂在离心管壁或微量滴定板孔壁时.应离心使之沉入底部。

5.将5x标记混合液用冰预冷的水稀释5倍,每种测序反应需要2ul稀释的标记混合液。

6.用冰预冷的测序酶稀释缓冲液稀释测序酶,如材料中所述可加,也可不加酵母焦磷酸酶。
毎种模板测序需要测序酶(含3单位)。测序酶要始终放置于冰上。



7.为进行标记反应,在步骤2的10ul退火反应液中加入如下溶液:

稀释的标记混合液(来自步骤5)                             2ul
0.1mol/L二硫苏糖醇                                               1ul
[a-33P]dATP,[a-32P]dATP或[a-35S]dATP                  0.5ul
稀释的测序酶(约1.6u/ul)                                            2.0ul

轻轻拍打离心管壁或滴定板以便混匀反应物,然后在20°C孵育2~5min。
稀释的测序时应保存在冰上,不要使其温度升至室温。供应商提供的浓缩酶应贮存于-20°C,如果置于冰上几小时酶将失活。

8.在标记反应将近完成时,应于37°C预热离心管或微量滴定板以便进行终止反应。这—步很重要。然后,转移3.5ul标记反应液到已经预热的、做好标记的、已加入适量的双脱氧混合液(上述步骤4)的微量离心管壁或微量滴定板孔壁上。

9.在室温下,将微量离心管放入微量离心机中(用适合于0.5ml离心管的转头或衔接头,或将其置于去盖的1.5ml离心管中),或将微量滴定板置于有适当衔接头的离心机中,以2000r/min离心C、T、A、G管或板几秒钟,混匀混合液。然后立即将反应物置于37°C加热板或水浴中3~5min。

10.加4ul甲酰胺上样缓冲液终止反应。

11.这些反应物在-20°C时可最多保存5天,也可以用变性凝胶电泳直接分析(见方案8、9、或10、11和12)。热变性后(100°C,2min),在冰上快速冷却。取C、T、A和G反应物各3ul加入测序凝胶的各孔中。





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