一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

琼脂糖

二甲基亚砜（见注释1)(DMSO)

溴化乙锭

乙酸镁（见注释2)[(CH₃COO)₂Mg]25mmol/L(AppliedBiosystems4339582/4339585)

去除RNA酶的水

SYBRGreenIDye(见注释1)(分子探针）

2.酶和酶缓冲液

5XAccuRT缓冲液（见注释2)(AppliedBiosystems4339582/4339585)

GeneAmpAccuRTRNAPCR酶（见注释2):3.75U/ul(AppliedBiosystems4339585)

AmpErase尿嘧啶-N-糖基酶（UNG):1U/ul(AppliedBiosystems)

3.核酸和寡核苷酸

脱氧核苷三磷酸：中性10mmol/L溶液（AppliedBiosystems，N808-0007/N808-0095含20mmol/LdUTP以替代dTTP)。

寡核苷酸引物：15umol/L溶于10mmol/LTris-HCl溶液,pH8.3。

RNA：通常保存于含载体RNA的溶液中，如30ug/mlE.colirRNA或poly(rA)，或保存于10mmol/LTris-HCl、pH7.0，lmmol/LEDTA,0.lmmol/LNaCl中，两者都需去除RNA酶的水。

4.特殊设备

琼脂糖凝胶的电泳设备

GeneAmpPCR系统9700/2700(AppliedBiosystems)或类似产品实时定量PCR检測系统（见注释1):例如AppliedBiosystems的GeneAmp5700测序系统或ABIPRISM7000、7700/7900HT测序系统或RocheAppliedScienceLightCycler

5.其他

MicroAmp反应管（AppliedBiosystems)或类似产品



二、方法

1.RNA分离

制备高质量的RNA极为重要，对此市场上有许多商业化产品以及详细的方法可用

(DieffenbachandDveksler1995;Farrell1998;SambrookandRussell2001;第10章）。

2.RT和PCR扩增的组合

(1)有dTTP而无UNG下进行的反应

①解冻所有试剂，轻微振荡，避免产生泡沫。

②在微型离心机中将酶和试剂甩至管底，置冰上。

③混合下列试剂（注意：黑体字项目在有dUTP和UNG时浓度是不同的）。



④轻微振荡上述混合物，加1.00ulRNA(至1ug，见16.1疑难解答和技巧），轻微振荡整个反应混合物。可以使用任何比例的去除RNA酶的水和RNA的混合物，只要主要混合物和RNA的总体积等于50ul。

⑤在GeneAmpPCRSystem9700/2700上按下列程序进行反应。

65°C，保持30min(反转录）

95°C，保持lmin

95°C，15s;65°C，30s,进行40个循环（PCR扩增）

65°C,保持7min

⑥反应物可直接用于分析或于-20°C储存。

(2)使用dUTP和UNG进行反应（针对污染控制系统和UNG介导的热启动）

①解冻所有试剂，轻微振荡，避免产生泡沫。

②在微型离心机中将酶和试剂离心到管底，置冰上，

③混合下列试剂（注意：黑体字项目在进行有dTTP和无UNG反应时使用不同浓度）。



④轻微振荡上述混合物，加1.00ulRNA(至1ul;见16.1疑难解答和技巧），轻微振荡整个反应混合物。可以使用任何比例的去除RNA酶的水和RNA的混合物，只要主要混合物和RNA的总体积等于50ul。

⑤在GeneAmpPCRSystem9700/2700上按下列程序进行反应。

50°C,保持2min(UNG步骤)

65°C，保持30min(反转录步骤）

95°C，保持lmin

95°C,15s;65°C，30s,进行40个循环（PCR扩增）

65°C，保持7min

⑥反应物可直接用于分析，为使UNG失活，可于-20°C：储存或进行化学处理（如用等体积的氯仿进行抽提），因UNG长期存在会破坏扩增产物。反应物可长期储存于-20°C：。UNG在分析之前不需要进行失活，然而在室溫或者低于55°C时它能破坏反应中的复制子。

3.反应产物分析

为检测扩增产物，可用含0.5ug/ml溴化乙锭（EB)的2%琼脂糖进行电泳，也可用实时定量PCR的TaqMan技术（Mengetal.2001)。用EB(HiguchiandWaston1999;KangandHolland1999;Kangetal.2000;Holland2002)或SYBRGreenI(Baranzinietal.2000)染色，通过EB或SYBRGreenI结合反应产物双链DNA发出的荧光来检测。当使用SYBRGreenI时，浓度控制非常重要，20倍母液存于100%DMSO(20倍母液指500倍SYBRGreenI存于DMSO溶液），使用的最终浓度为0.2倍，高于该浓度据证实会抑制RT反应的许多酶的活性。