【求助】逆转录酶的Buffer问题
2013-10-28
问题描述：
各位高手！
最近遇到了实验上的大问题，就是用一步法做RNA的荧光定量PCR时，发现低浓度的做不出来，而DNA是可以的，想请问各位在一步法PCR中有没有什么高见，就是逆转录的Buffer有没有什么需要注意的地方！就是在逆转录酶的最适Buffer和Taq酶的最适Buffer中寻找一个最适的Buffer！
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瞿同学
用户
我用的TAKARA的实时荧光定量PCR试剂盒，东西都是配好的，不需要调整buffer的量，用起来效果挺好的，可以建议你用这个哦，零售价大概1100-1500左右
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wujp26
用户瞿同学我用的TAKARA的实时荧光定量PCR试剂盒，东西都是配好的，不需要调整buffer的量，用起来效果挺好的，可以建议你用这个哦，零售价大概1100-1500左右你用的CT值能做到多少？能到CT34以后吗？
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瞿同学
用户没看懂你的意思，CT值是循环数，其实反映的是你的基因的表达量，改变Ct值，可以调整原始的CDNa浓度啊，一般测到的Ct值大概是28-30，这个是根据你的基因不同来定的呀
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chao_yw
用户果断用商业化的试剂，楼上提到的TAKARA是一个可以的选择。另外Ct值一般大于33后都是不太能接受的，像你说的34一般审稿人都会提出质疑的（主要针对SYBRGreen）。
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wujp26
用户瞿同学没看懂你的意思，CT值是循环数，其实反映的是你的基因的表达量，改变Ct值，可以调整原始的CDNa浓度啊，一般测到的Ct值大概是28-30，这个是根据你的基因不同来定的呀我的意思是用CT24左右的CDNA去稀释，按10倍梯度稀释，但是后面的就没有了，其实样本的有的，但是它就是不能逆转录出来，所以就没有扩增的曲线，然后就没有CT值。
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wujp26
用户chao_yw果断用商业化的试剂，楼上提到的TAKARA是一个可以的选择。另外Ct值一般大于33后都是不太能接受的，像你说的34一般审稿人都会提出质疑的（主要针对SYBRGreen）。有没有人自己配Buffer啊？
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chao_yw
用户有当然有，但是一般不会比商业产品的好。这时候不应该心疼钱。另外救市何必要用一步法呢？转成CDNA后有利于样品保存，并且想做定量PCR时就可以做，都不用重新提RNA。
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cyqcan
用户各位高手！最近遇到了实验上的大问题，就是用一步法做RNA的荧光定量PCR时，发现低浓度的做不出来，而DNA是可以的，想请问各位在一步法PCR中有没有什么高见，就是逆转录的Buffer有没有什么需要注意的地方！就是在逆转录酶的最适Buffer和Taq酶的最适Buffer中寻找一个最适的Buffer！请问一下，你现在找到那个合适的buffer了吗？
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