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聚合酶链式反应(PCR)
来自 : 蚂蚁淘

一、标准的PCR反应体系 
 

10×扩增缓冲液  10ul
 
4种dNTP混合物 各200umol/L
 
引物       各10~100pmol
 
模板DNA    0.1~2ug
 
TaqDNA聚合酶  2.5u
 
Mg2+      1.5mmol/L
 
加双或三蒸水至  100ul
 
二、PCR引物设计 

PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

1. 引物设计的基本原则

(1) 引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。

(2) 引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

(3) 引物内部不应出现互补序列。
 
(4)两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3′端的互补重叠。
 
(5) 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
 
(6)引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。

(7) 引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。

2. 引物设计软件

PrimerPremier5.0(自动搜索)*、Oligo6(引物评价)、VectorNTISuit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3(在线服务)。

三、模板的制备 

(1)PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。

(2)模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

(3)标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、氯仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

四、PCR反应条件的控制 

1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子。 

2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5mmol/L。
  
3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200umol/L。
 
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100ul)。
  
5. 引物浓度一般为0.1~0.5umol/L。
 
6. 反应温度

(1)变性温度和时间95℃,30s。

(2)退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右,一般在45~55℃。

(3)延伸温度和时间72℃,1min/kb(10kb内)。

(4)Tm值=4(G+C)+2(A+T)

7. 循环次数:一般为25~30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。

五、PCR的循环参数 
 
1. 预变性(Initialdenaturation)

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2. 循环中的变性步骤

循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。

3. 引物退火(Primerannealing)

退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4. 引物延伸

引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略

延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5. 循环数

大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。

6. 最后延伸

在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。

六、PCR步骤 
 
1. DNA变性

(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。

2. 退火

(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

3. 延伸

(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。

七、PCR检测 
 
PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。


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