【分享】DNA甲基化分析亚硫酸氢盐修饰
2008-04-21
问题描述：
最近看了很多帖子关于DNA甲基化研究的，我也正研究这方面的内容，就想跟各位大虾一起探讨探讨：
首先，关于DNA抽提的，我之前用的是离心柱抽提试剂盒（tiangen），但是柱型抽提过程中难免损失掉不少的DNA,要是细胞数多的话还才凑合的可以用（我抽的是细胞的DNA），细胞数要是少了，我都很担心抽提到的DNA太少了，做一次修饰如果没成功还得重新养细胞，挺费时的，尤其我后面部分打算做胚胎的那就更少了，不知哪位大虾有没其他好的建议。
还有就是涉及到DNA抽提过程中加入RNaseA的，我们市购的RNaseA是要经过处理灭火DNA酶活性的，但就不知在反复冻融使用中会不会又恢复了DNA酶活性，到头来连DNA都抽提不到了，或是严重损失，其实我个人还有个想法就是接下来的DNA修饰中不是会降解掉绝大部分的DNA吗，那RNA应该是更容易降解的才对，是不是都可以不必要加RNaseA呢，虽然对我们的所要修饰的DNA的量的估计有所干扰，但是我看了很多文献好像对于这个量本来就是没有十分明确的，看了蚂蚁淘上的战友也是各有所见，不知哪位大虾能给个比较权威的说法
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yjf06017
用户
再下来就是关于这个修饰时间的，我看过一篇老外研究，专门针对修饰时间和浓度的不同结合，其中提到的是55°/4h与55°/16h均可以达到完全修饰，我刚开始也觉得很是奇怪，时间怎么可以差这么多，后面又有看到一篇外文也是只修饰4h，不知有哪位大虾修饰4h达到好的试验结果的，如果可以将绝大多数人采用的16h取而代之4h，那么不就可以很好的减少DNA降解的量吗，据我所看到的研究DNA的降解是随着时间推进而增加的
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yjf06017
用户对于修饰液的配置呢，本人还是存在一定的困惑，首先先说下对苯二酚的配置，因为每次用量很少，又要求新鲜配置，我是先配置成50X的浓缩液，每次拿一管现稀释现用，这样是不是也算新鲜配置呢（对苯二酚的溶解度很低，本想配置100X，发现室温下根本没办法溶解）再来就是硫酸氢钠溶液配置，我是取1.5609g粉末溶于约4.5mlDDW中，配成3M工作液浓度，并用NaOH溶液调节pH至5.0，最后定容为5ml，我有看到有些园友配置成的硫酸氢钠浓度好像大于3m，我帮忙算了下应该是3.6-3.9M，最近我自己也在查看看到底是要多少浓度合适，如果哪位大虾知道希望可以跟我们分享分享3MNaOH溶液也是要新鲜配置的保证其Ph值不发生变化其他的溶液倒是不需要新鲜配置
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yjf06017
用户再接下来讲讲修饰后的沉淀和离心，时间一定尽量长，跟我们抽提DNA时的时间是不能相提并论的
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yjf06017
用户最后就是PCR产物的鉴定，我看有的是直接产物测序，但如果测序公司知道你是做甲基化的绝对不愿意接受，更多的是进行连接后转化挑单克隆，关于这里的蓝白斑筛选的，文章是说小于500bp的片段根本就可以不用蓝白斑，这时候即使出现篮斑也可能是假阴性，因为我目的片段是大约300bp，第一次做的时候涂板培养过夜居然没几个是蓝斑，难道都转进去了，我也不确定，测序结果还没出来，挑单克隆后的菌液一般也是要鉴定阳性后才送去测序的，但是我连的片段这么小抽提质粒直接跑电泳是根本没办法鉴别出来的，还是要酶切鉴定，可是这过程又要费很多时间，所以想问问各位大虾你们是怎么做的，
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yjf06017
用户有没有高手赶紧出来指导指导，我毕竟还是做改方面的新手啊
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yjf06017
用户怎么还是没有其他兄弟呢
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qasyu
用户我也是新手，高手在那里？呼唤高手中.......
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