HighlyThermostableDNAligaseforapplicationswhereligationathightemperatureisbeneficial
- HighthermostABIlityallowsligationusinghigh-stringencyhybridizationconditions
- HighspecificityandstringencypermitssensitivedetectionofSNPs11
Applications
Ampligase®ThermostableDNALigasecatalyzesNAD-dependentligationofadjacent3´-hydroxylatedand5´-phosphorylatedterminiinduplexDNAstructuresthatarestableathightemperatures.Derivedfromathermophilicbacterium,theenzymeisstableandactiveatmuchhighertemperaturesthanconventionalDNAligases.Itshalf-lifeis48hoursat65°Candgreaterthan1 hourat95°C.AmpligaseDNALigasehasbeenshowntobeactiveforatleast500thermalcycles(94°C/80°C)or16hoursofcycling.10Thisexceptionalthermostabilitypermitsextremelyhighhybridizationstringencyandligationspecificity.AmpligaseDNALigasehasnodetectableactivityinligatingblunt-endedDNAandhasnoactivityonRNAorRNA:DNAhybrids. UnitDefinition:OneunitofAmpligaseDNALigasecatalyzestheligationof50%ofthecossitesin1µgoflamBDaDNAin1minuteat45°Cin1XAmpligaseReactionBuffer. Note:OneunitofAmpligaseDNALigaseisequivalenttoatleast15ofthe"cohesiveendunits"or"nickligationunits"definedelsewhere.4 StorageBuffer:50%glycerolcontaining50mMTris-HCl(pH7.5),0.1MNaCl,0.1mMEDTA,1mMDTT,and0.1%Triton®X-100. Ampligase10XReactionBuffer:200mMTris-HCl(pH8.3),250mMKCl,100mMMgCl2,5mMNAD,and0.1%Triton®X-100. QualityControl:AmpligaseThermostableDNALigaseisassayedfortheabsenceofblunt-endligationactivitybyligatingSmaI-digestedbacteriophagelambdaDNAat45°C;ligationoccursonlyatcossitesasdeterminedbygelelectrophoresis.AmpligaseDNALigaseisfreeofdetectableexo-andendonucleaseandRNaseactivities. References
|
ORDERINFORMATION
Ampligase™isprovidedatastandardconcentrationof5U/μl,withtheexceptionofcatalognumbersA0102KandA110K(100U/μl).
AmpligaseDNALigaseKitcontains:AmpligaseDNALigase,10XReactionBuffer,andControlDNA.AmpligaseEnzyme&Buffercontain:AmpligaseDNALigaseand10XReactionBuffer(25μlBufferforeach50Uenzyme).
OneunitofAmpligase™isequaltoasmanyas15unitsofotherthermostableDNAligases.Pleasecomparecompetitiveunitdefinitions.
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
(1)玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染,使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间(玻璃器皿)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂,但其作用并不是绝对的(Fedorcsak和Ehrenberg,1966)。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时,然后用灭菌水淋洗数次, 并于100℃干烤15分钟(Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净,再用水冲洗,用乙醇干燥,然后灌满3%的H2O2溶液,于室温放置10分钟,然后用0.1 %DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记,存放在指定地点,为RNA实验专用。
(2)研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此,在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时,主有涉及RNA的一切操作过程中,都应戴一次性手套,接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此进行RNA实验时应勤换手套。
(3)污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1%DEPC于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注:DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
(二)已经污染,可以加入RNA酶的抑制剂
(1)RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合(KI≈3x1010)形成非共价结合的等摩尔复合物,使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂,血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子, 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂,该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的50%甘油中,贮存于-20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用,因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此,在使用变性剂裂解哺乳动物(mammal;mammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂,并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂,故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂,而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
(2)氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒(1V)离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物,是量种过渡态类似物,它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中,在RNA提取和纯化的所有过程中,其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译, 并能作为某些外酶促反应(如mRNA反转录)的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译,因此必须用含0.1 %羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。
(3)Macaloid(硅藻上)Macaloid是一咱粘土,很多年前就发现它能吸附RNA酶,用缓冲液将其制成浆液,以0.015%(W/V)的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中(如酚抽提后)经离心去除。
(三)提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质,从而免受RNA酶的干扰。
限制性核酸内切酶的研究和应用发展很快,已提纯的限制性核酸内切酶有100多种,许多已成为基因工程研究中必不可少的工具酶。
限制性核酸内切酶可被分成三种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP,全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。
Ⅰ型和Ⅲ型酶具有限制和修饰两种作用,而特异性弱,切割位点的序列不固定,不已知,不宜用于基因克隆中。
Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA,能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。因此,被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。
限制性酶主要分为三种类型:Ⅰ型限制酶为复合功能酶,具有限制-修饰两种功能,但在 DNA链上没有固定的切割位点,一般在离切割位点1kb到几kb的地方随机切割,不产生特异性片段。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶基本相似,不同的是Ⅲ型酶有特异性的切割位点,但这两类酶对 DNA酶切分析的意义不大,通常所说的限制性内切酶是指Ⅱ型酶,它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸顺序,产生特异性的DNA片段。
2.识别序列及消化产物的末端结构 限制性酶的识别序列,大部分具有双轴对称性结构或称回文序列,如EcoRI的识别序列为:
GAA
TTC
横轴
CTT
AAG
纵轴
将纵轴一侧的序列以横轴为中心旋转180°,则纵轴两侧的序列相互对称,这种结构又称为双重对称结构。大部分酶的识别序列长度为4-6个核苷酸。4核苷酸序列在DNA链中出现频率高,对一随机排列的DNA分子来说,理论值为1/44,因此4核苷酸识别序列的限制性酶在DNA链上切点多,产生片段的数目多,长度短,显示出酶的特异性较低。对于5和6核苷酸识别序列的酶,出现频率分别为1/45和1/46 ,因此,6核苷酸序列在DNA中出现频率低,酶的特异性强,而8核苷酸识别位点在DNA链中出现机率更低(1/48 ),特导性更强,可提供更长的DNA片段。一部分限制性酶具有非典型的双轴对称性序列,其回文识别序列被个或几个其他核苷酸所间隔,如BglⅠ,这种酶的特异性比识别长度相同的典型回文序列的酶略高。另外有些限制性酶(约10种,如BbVⅠ等),其识别序列不表现为回文结构,它们降解双链DNA时,酶切点大部分不在识别序列内,而是与识别序列相距5至13个核苷酸残基不等。
限制性酶切片段的末端结构:限制性酶不但有特定的识别序列,并且任何一种酶切割 DNA链时,总是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯键的3’位磷酸酯键,使产物的5’端带磷酸单酯基团,而3’末端则为游离羟基。因此某一种酶的全部产物的末端具有相同的结构。根据切点序列的结构特点,产物的末端可分为粘性末端和平末端两类。粘性末端指酶切后DNA片段末端带有1-4个核苷酸残基的单链结构,而片段两端突出的单链具有互补性,突出的单链因部位的不同,又可分为5’-与3’-粘性末端两种,突出的单链带5’磷酸单酯的称5’-粘性末端,而突出的单链含3’-羟基则称3’-粘性末端。平末端指酶切后,片段为齐头末端结构。在DNA体外重组时,粘性末端是DNA连接酶的有效底物,有很高的连接效率。向左转|向右转
第一种方法是,用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段;
第二种方法是,用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来,或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)-poly(dT)尾巴之后,再用DNA连接酶将它们连接起来;
第三种方法是,先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头,使之形成粘性末端之后,再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异,但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。
粘性末端DNA片段的连接
DNA连接酶最突出的特点是,它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用,形成重组的DNA分子。
平末端DNA片段的连接
常用的平末端DNA片段连接法,主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。
同聚物加尾法
这种方法的核心部分是,利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶,它能够将核苷酸(通过脱氧核苷三磷酸前体)加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH基团上。由核酸外切酶处理过的DNA,以及dATP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中,DNA分子的3′-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段,称之为poly(dA)尾巴(图2-7)。反过来,如果在反应混合物中加入的是dTTP,那么DNA分子的3′-OH末端将会形成poly(dT)尾巴。因此任何两条DNA分子,只要分别获得poly(dA)和poly(dT)尾巴,就会彼此连接起来。这种连接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴连接法(homopolymertail-joining),简称同聚物加尾法。
衔接物连接法
所谓衔接物(linker),是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端,用多核苷酸激酶处理使之磷酸化,然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子,这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是我们便可以按照常规的粘性末端连接法,将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。
DNA接头连接法
DNA接头,是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后,便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子,而易于连接重组。实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造,可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。
近日,国际微生物学权威期刊MolecularMicroBIOLOGy在线发表了上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室由德林教授研究小组的最新研究进展“RegulationofDNAphosphorothioatemodificationsbythetranscriptionalregulatorDptBinSalmonella”。该研究揭示了DNA磷硫酰化修饰在转录水平上调控的分子机制。
DNA磷硫酰化修饰是近年发现的一种新型表观遗传学生理修饰,该修饰位于DNA大分子骨架上,由硫原子取代了DNA磷酸骨架上非桥联氧原子而形成了具有序列特异性和空间构象专一性的磷硫酰化修饰。这种新型表观遗传学修饰的调控机制目前尚不清楚,但该发现拓展了经典的DNA组成理论,在国内外引起了广泛关注。
由德林教授研究小组成秋香和曹博研究发现,敲除沙门氏菌中控制磷硫酰化修饰基因dptBCDE中的dptB基因后,细胞内磷硫酰化修饰水平增强,同时在细胞快速生长时期,该基因的下游DNA磷硫酰化基因转录水平明显增高。当用dptB基因回补其突变株时,下游修饰基因的转录和细胞内磷硫酰化修饰恢复到与野生型沙门氏菌相当水平,表明dptB在转录水平上负调控DNA磷硫酰化修饰基因的表达。同时,通过精确定位DptB在DNA磷硫酰化修饰基因上游调控区的2个DNA结合区域,研究小组发现每个靶序列中都含有1对保守的正向重复序列,进一步研究也表明,这种负调控机制是DNA磷硫酰化修饰中普遍存在的调控方式。
该研究是由德林教授研究小组继破译DNA磷硫酰化修饰基因组图谱(Caoetal,NatureCommunication,2014,5:3951),解析DNA磷硫酰化修饰限制系统作用机制(Caoetal,MolecularMicrobiology2014,93(4):776-85)之后,在这种新型表观遗传学修饰生物学研究上的又一重要进展,对理解基因组上的低频率的修饰机制和修饰的生理功能具有重要的意义。
文章链接:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mmi.13096/pdf
------发现两种全新的细胞自我防卫机制
来源:上海交通大学
近日,上海交通大学邓子新院士团队对DNA骨架硫修饰生物学意义的研究又获得两项突破。
聚焦核酸研究的著名国际学术刊物《核酸研究》(NucleicAcidsResearch)以特写文章(Featuredarticle)发表了由该团队由德林副教授主持,博士生徐铁刚和姚芬为共同第一作者的论文——“沙门氏菌中与DNA骨架上硫修饰直接关联的一种新的限制系统”。该论文报道了一种新的宿主专一性限制-修饰系统,它与以前所熟知的DNA甲基化限制-修饰系统截然不同,由7个基因负责,其功能与DNA骨架上的硫修饰直接相关。编辑部在特写中写道:“在沙门氏菌中所发现的这种宿主专一性硫修饰系统看来是细菌为了抵御外源对DNA的限制性所装备的又一种新的细胞防卫机制,它被一种新的途径酶所编码,堪比细菌在依赖于DNA甲基化之外加装了又一套新的防御体系。”
与之相反的另一套全新的细胞防卫系统发现于天蓝色链霉菌中,由贺新义副教授主持,博士生刘光为第一作者,以“一种IV型限制内切酶ScoMcrA对硫修饰和甲基化修饰DNA都切割”为题发表在《公共科学图书馆—遗传学》(PLoSGenetics)上,这种酶不仅可以切割DNA骨架上发生了硫修饰的DNA,还可以切割DNA碱基上发生了甲基化修饰的DNA。另外,这套限制-修饰系统分别位于两个相互排斥的基因组岛上,具有“水火不容”的敌对性,两者同时表达会导致细胞瞬时死亡。论文评审员称这是一篇“重要的、epoch-making”的论文。这项发现是上海交大与中国科学院微生物研究所和英国Leicester大学合作的结晶。
这是邓子新院士团队发现DNA骨架硫修饰以来,瞄准科技界普遍关注的有关DNA硫修饰的生物学,尤其是修饰的生理功能这个重大的科学问题公开发表的新的引人注目的原创性成果。与DNA甲基化限制-修饰系统一样,这类新系统的广泛和深度挖掘可能具有重大的分子生物学和生物工程学意义。
目前,DNA骨架硫修饰的研究已成为该团队瞄准前沿,奋力开拓的主要科研方向之一,自他们首次报道DNA硫修饰以来,已先后发表了十余篇相关的系统性研究论文,稳步地把对此新兴领域的研究推向新的高度。
据悉,2010年初,中国微生物学会为了促进、激励和纪念DNA硫修饰这个原创性科学发现,彰显我国基础生命科学领域的显示度和影响力,决定在上海交通大学设立“DNA大分子硫修饰科学发现诞生地”纪念牌。
分子克隆在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入DNA的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。
工具酶:基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶,连接酶,聚合酶,核酸酶和修饰酶五大类。其中,以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。
暂无品牌问答