实验一、质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳
来自 : mayitao
一．实验目的：1、掌握质粒DNA分离，纯化的原理2、学习煮沸法快速提取质粒DNA的方法3、学习DNA的限制性酶切的基本技术4、学习利用琼脂糖电泳测定DNA片段的长度二、实验原理在基因工程中，DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA序列，在一定的条件下切断双链DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA的纯度和甲基化程度等。对DNA进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。DNA的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。SDS等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。三．实验材料和试剂：1．菌种：含pUC18的大肠杆菌JM107菌株。2．化学试剂和溶液（1）LB培养基：NaCl10g/l酵母提取物5g/l胰蛋白胨10g/l氨苄青霉素50μg/ml（培养基灭菌后加入）pH7.0（2）70%乙醇（-20℃）及无水乙醇（-20℃）（3）STET缓冲液（pH8.0）（8%蔗糖，0.5%Triton,50mmol/LEDTA,,10mmol/LTris）（4）5%CTAB（十六烷基三甲基溴化氨）（5）1.2M氯化钠（6）TE缓冲液（10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA）（7）电泳缓冲液（50XTAE）Tris242g，冰醋酸57.1ml，EDTA(0.5mol/LpH8.0)100ml使用时用蒸馏水稀释50倍。（8）样品缓冲液（6X）0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%（W/V）蔗糖（9）溴化乙锭10mg/ml（10）琼脂糖（电泳级）（11）限制性内切酶（12）溶菌酶（50mg/ml，溶于10mmol/LTris-HCl，pH8.0）3.仪器设备:台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。Eppendorf离心管，Tip头，三角瓶等灭菌备用。电泳仪，电泳槽，样品梳，微波炉，水浴锅，移液器（20ul,200ul和1000ul），离心管，Tips(200ul,1000ul)。
四．操作步骤：1.质粒提取（1）将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在37℃剧烈震荡（250rpm）培养过夜。（2）将1.5ml培养物转入离心管中，用台式离心机在4℃条件下离心30秒（12,000×g）。（3）弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于200mlSTET缓冲液，用涡旋混合器充分混匀。（4）加入4ml新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下5min。（5）用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻离心10min。（6）用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8ml5%CTAB，用混合器混匀后，高速离心5min，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。（7）加入1.2M氯化钠300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的冷乙醇，充分混匀后，离心15min，弃上清液。（8）取1ml70%冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心5min。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min。（9）沉淀物溶于50mlTE缓冲液中，混合器混匀。（10）即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用加完反应液，混匀，离心1分钟，置于370C水浴中，反应2小时。加入加样缓冲液（10′）2ml3.质粒DNA的琼脂糖电泳1)量取100毫升TAE电泳液，加入0.7克琼脂糖，混匀后，置于微波炉中，加热3分钟，充分溶解琼脂糖。注意观察，当心煮沸的液体，溢出！2)用灭菌后的橡皮胶，封闭清洁干燥的电泳板，并用少量的琼脂糖液封边。安放梳子，调整梳子的底部边缘与电泳板之间的距离，一般以1-2毫米为宜。3)当溶解后的琼脂糖液冷却至500C左右时，加入溴化乙锭5ml，溴化乙锭的最终浓度为1.0mg/ml.混匀后，将琼脂糖液倒入电泳板中，静止，切勿移动。4)在凝胶完全凝固后（于室温放置30-45分钟），轻轻地取出梳子，除去胶带，将凝胶放入电泳漕中。5)电泳漕中，加入电泳液（1′TAE），使电泳液覆盖在琼脂糖胶面之上约1-2毫米。6)取上一实验制备的质粒提取液（酶切），加入1/5样品缓冲液，充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中，分别加入DNA分子量标记物（Marker），对照以及质粒提取液（酶切）样品7)接通电源，在90V下，电泳1小时，当溴酚兰颜料迁移至凝胶前沿时，切断电源。8)取出凝胶，在紫外灯下，观察DNA的迁移位置，并讨论实验结果。五、注意事项:(1)从细菌沉淀中或核酸沉淀中去除上清液时，一定要彻底，不能留有残余。(2)用70%的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分小心，防止将核酸同洗液一起去掉。(3)在实验过程中所用的器皿和吸头等都要进行高压灭菌。(4)酶切时，应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。(5)进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶，并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱(6)溴化乙锭是一种强烈的致癌物质，使用时必须带手套。实验结果后，含溴化乙锭的凝胶要进行净化处理。
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