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2024-04-24
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(一)从源头控制污染:(1)玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染,使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间(玻璃器皿)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂,但其作用并不是绝对的(Fedorcsak和Ehrenberg,1966)。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时,然后用灭菌水淋洗数次, 并于100℃干烤15分钟(Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净,再用水冲洗,用乙醇干燥,然后灌满3%的H2O2溶液,于室温放置10分钟,然后用0.1 %DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记,存放在指定地点,为RNA实验专用。(2)研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此,在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时,主有涉及RNA的一切操作过程中,都应戴一次性手套,接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此进行RNA实验时应勤换手套。(3)污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1%DEPC于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注:DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。(二)已经污染,可以加入RNA酶的抑制剂(1)RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合(KI≈3x1010)形成非共价结合的等摩尔复合物,使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂,血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子, 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂,该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的50%甘油中,贮存于-20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用,因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此,在使用变性剂裂解哺乳动物(mammal;mammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂,并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂,故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂,而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。(2)氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒(1V)离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物,是量种过渡态类似物,它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中,在RNA提取和纯化的所有过程中,其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译, 并能作为某些外酶促反应(如mRNA反转录)的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译,因此必须用含0.1 %羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。(3)Macaloid(硅藻上)Macaloid是一咱粘土,很多年前就发现它能吸附RNA酶,用缓冲液将其制成浆液,以0.015%(W/V)的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中(如酚抽提后)经离心去除。 (三)提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质,从而免受RNA酶的干扰。
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