T4连接酶连不上，求各位大神帮忙！！！
2021-08-04
问题描述：
各位大神好，我刚开始做连接，用的T4连接酶，takara的，16度连了12h，转了感受态没长菌斑，我的载体酶切后11000bp，我要连上去的片段在760bp，用的是salI和BglII双酶切后看胶图应该是没有问题，第一张图是当时酶切的图，从左至右是2kplusIIMarker，片段双酶切，片段原质粒，片段salI单酶切，片段BglII单酶切，载体双酶切，载体原质粒，载体salI单酶切，载体BglII单酶切，从图中看酶切应该是切开了，就是片段在750bp的条带有点弱，但还是有条带的。现在不太清楚是什么原因，能帮忙分析一下吗？第二张胶图是胶回收之后定量的，从左侧第一个点样孔是2kplusII的marker，第二个是片段双酶切胶回收3微升点样，第三个是载体双酶切胶回收3微升点样。连接体系是10微升，1.5的酶，1的buffer，6.5的片段，1的载体，但就是连不上，各位帮忙分析一下吗，不胜感激
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mpark
用户
What kind of comptent cells did you use for transformation? What kind of vector is it, lentiviral transgene vector or regular mammalian expressing vector? Did you precipitate the gel purified insert and vector DNA with ethanol before setting up the ligation? Did the T4 DNA ligase used in your ligation work in other cloning ligations?If there is some of the ligation left, you can try to make 1:5 dilution with sterilized ddH2O and use 3-5 ul of the diluted ligation for transformation. If not, try to make ligation again and incubate the ligation at room temperature overnight, make 1:5 dilution and take 3-5 ul of the diluted ligation for transformation using NEB stable competent cells.If you could not have any colony after you have done more transformation, try to do gel pupurification of insert and vector fragments using low melting temperature agarose gel and make PHENOL ONLY extraction, then clean the DNA with phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation in the presence of glycogen.
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NEB
用户图2：在20µl反?µ逑抵校?貌煌?康腡4DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/HaeⅢ片段。16°C温育30分钟。
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NEB
用户二、常见问题及解答Q1：有哪些潜在原因可导致用T4DNA连接酶连接后转化失败?A1：反应体系内无ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNA。去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。连接末端为单碱基突出末端：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。插入片段和质粒没有磷酸化。注意：如果载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。加入过多的连接混合物至感受态细胞：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。连接酶失活：用lamBDaHindIII或其它可行的底物进行检测。连接混合物含有PEG且连接反应过夜：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率。快速连接试剂盒（NEB#M2200）的buffer含有PEG。电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞。可用透析或柱纯化的方法纯化连接混合物。虽然快速连接试剂盒（NEB#M2200）buffer中含有的PEG不会导致击穿细胞，但是会抑制电转化，所以必须去除，可用柱纯化方法去除PEG。Q2：解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？A2：感受态细胞出了问题：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。细胞不是感受态：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用pMAL系统（NEB＃E8000S）表达MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白，或者试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。连接的DNA片段含有反向重复的序列，不能用大肠杆菌筛选：如果可能去除重复序列，或试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC和mrr缺失菌株。重组子太大（>10,000bp）不能进行化学转化：用电转化。Q3：内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4DNA连接酶连接和后续的转化失败？A3：内切酶酶切不充分：如果酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。内切酶没有完全失活：如果内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。内切酶的星号活性消化了载体或插入片段：跑胶检测DNA，如果存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注意事项，如果连接QC不佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。Q4：使用T4DNA连接酶，需要设置什么对照来检测细胞和DNA。A4：注意：每个对照组都使用相同浓度的DNA，一般为0.1-1.0ng/转化。转化空载体（未切割的）至感受态细胞，目的：检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性。分别涂布于含有和不含有抗生素的平皿上。转化线性化后的载体，目的：检测未切开质粒的量，克隆数应该小于步骤1的1％。酶切再连接质粒，目的：检测连接酶的活性以及DNA末端的完整性。克隆数应该与步骤1相近。酶切后去磷酸化再连接质粒，目的：检测未完全去磷酸化的背景。克隆数应该小于步骤1的1％。Q5：什么情况下选用T4DNA连接酶？A5：T4DNA连接酶应该被用来连接粘性末端（室温10分钟）或平末端（室温2小时），或者连接反应需要过夜。如果需要热失活连接酶，选用用T4DNA连接酶。高浓度T4DNA连接酶被用来连接单碱基突出末端，或连接需要长时间孵育来环化的大片段，比如BAC（细菌人造染色体）结构。Q6：T4DNA连接酶能与快速连接buffer兼用吗？A6：可以，高浓度T4DNA连接酶可以直接取代，如果是普通浓度的T4DNA连接酶，将孵育时间从5分钟延长到15分钟。不要进行热失活，因为加热会让buffer内的PEG抑制转化。反应时间延长也会降低转化效率。Q7：T4DNA连接酶连接应该加多少DNA？A7：单位定义用的是0.12μM(300μg/ml)lambdaHindIII。高浓度的DNA用于linker的连接。为了促进环化（有利于转化），应该控制总DNA浓度于较低水平。载体＋片段总浓度应为：1-10μg/ml。插入片段和载体的摩尔浓度比介于2-6之间，比例低于2:1会降低连接效率，高于6:1会促进形成多个插入。如果对DNA的浓度不确定，可以做不同比例的多个连接反应。Q8：T4DNA连接酶可在其它NEBuffers中使用吗？A8：连接可以在内切酶所有4个标准buffer和T4多聚核苷酸激酶的buffer中进行，但需要加终浓度为1mMATP。确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。当使用NEBuffer3时，如果DNA中盐浓度较高可导致连接效率下降。Q9：T4DNA连接酶可以热失活吗？A9：可以，65°C孵育20分钟可以失活。如果buffer【快速连接试剂盒（NEB#M2200）内的buffer】中含有PEG则不可热失活，否则会抑制转化。Q10：Weiss单位（韦氏单位）与NEB粘性末端单位如何换算？A10：一个NEB粘性末端单位等于0.015Weiss单位，即一个Weiss单位等于67个NEB粘性末端单位。
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NEB
用户二、关于NEBM2200T4DNA快速连接试剂盒的使用方法和常见问题及解答1、产品特性介绍以及使用方法产品说明：本试剂盒可在室温(25°C)5分钟条件下，完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。应用：DNA片段克隆入载体文库构建TA克隆Linker连接线性DNA的再环化快速连接试剂盒的优点：快速-粘性末端或平滑末端DNA片段的连接只需5分钟即可完成方便-可在室温条件下进行连接反应灵活-适合于各种常规连接反应试剂盒成分：QuickT4DNA连接酶(重组酶)2XQuickLigationBuffer贮存条件(连接酶)：50mMKCl,10mMTris-HCl(pH7.4),0.1mMEDTA,1mMDTT,200µg/mlBSA和50%甘油。2XQuickLigationBuffer：132mMTris-HCl，20mMMgCl2，2mMATP，15%Polyethyleneglycol(PEG6000)*，pH7.6@25°C。*美国专利号：4,582,802。注意：连接缓冲液用前彻底混匀，避免反复冻融。快速连接步骤:混合50ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10µl。加入10µl2×QuickLigationBuffer，混匀。加入1µlQuickT4DNA连接酶，彻底混匀。稍事离心，室温(25°C)作用5分钟。冰上冷却，然后转化或贮存于-20°C。不要热失活。热失活会急剧降低转化效率。转化步骤：快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，NEB推荐下述转化方法：冰上融化感受态细胞。在1.5ml微量离心管中，将约5ng(2µl)的连接混合物冷却。在DNA样品中加入50µl感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。冰上放置30分钟。37°C热休克2分钟，冰上冷却5分钟。加入950µl室温培养基，37°C温育1小时。取100µl样品铺在适宜的培养基上。37°C培养过夜。注意事项：用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在25°C5分钟达到反应终点,超过这个时间效果并不会更好。事实上，连接两小时后转化效率便会降低，如果25°C反应过夜，则转化效率会降至75%。待连接的纯化DNA片段可以溶解在双蒸水（最好是Milli-Q超纯水）、TE或其它稀释缓冲液中。要获得最适连接，在加2×QuickLigationBuffer前，调整载体DNA和插入片段的体积到10µl。DNA片段体积大于10µl的，则相应增加2×QuickLigationBuffer的体积使之占总反应体积的50%，同样，DNA连接酶的量也要加大。为保证有效连接，总的载体DNA+插入片段的浓度应当在1-10µg之间。对单插入来说，插入片段:载体比例在2-6之间最好,低于2:1就会导致低的连接效率,高于6:1则会导致产生多个插入。如果DNA片段的浓度不能确定，就以不同的比例做几个连接反应。电转化可以使转化效率提高几个数量级。在用快速连接反应产物做电转化以前，一定要降低PEG浓度。我们推荐使用柱离心式DNA纯化方法。连接进程曲线：LITMUS28载体(NEB#N3628)经EcoRⅤ切割(平滑末端)或HindⅢ切割(粘性末端)后，小牛肠碱性磷酸酶处理、胶回收纯化，作为连接载体；插入片段来自ΦX174DNA的HaeⅢ消化产物(平滑末端)或λDNA的HindⅢ消化产物(粘性末端)，分别以3:1的插入片段:载体比例按照快速连接程序进行连接。连接产物转化入化学方法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB-amp平板上37°C生长过夜。
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NEB
用户实验方案及应用示例：质粒的再环化：用50ng不含插入片段的线性载体通过快速连接程序进行。示例：LITMUS28克隆载体经HindIII消化后，反应混合物65°C温育20分钟使内切酶失活，然后用快速连接程序使DNA再环化并进行转化实验。载体:2.5µl(50ng)插入片段:无水:7.5µl2XQuickLigationBuffer:10µlQuickT4DNA连接酶:1µl结果(转化子/µg):对照质粒(未切割)1.3X107线性化质粒1.1X104再环化质粒2.1X107粘性末端插入片段的连接：以50ng线性去磷酸化的载体和3倍摩尔量的插入片段通过快速连接程序进行。示例：λDNA经HindIII消化后，两个2kb片段经胶回收方法共纯化，插入到经HindIII切割并去磷酸化的pUC19载体上，通过快速连接程序连接DNA片段并转化。载体:3.3µl(50ng)插入片段(3:1):4.9µl(122.5ng)水:1.8µl2XQuickLigationBuffer:10µlQuickT4DNA连接酶:1µl结果(转化子/µg):对照质粒(未切割)2.0X107不含插入片段的载体1.1X105载体+插入片段2.1X106平滑末端插入片段的连接：用50ng线性去磷酸化载体和3倍摩尔量的插入片段通过快速连接程序进行该实验。示例：以λDNA为模板，通过PCR方法获得两端含EcoRV酶切位点的1.9kb片段，经EcoRV消化后产生平滑末端，然后插入到经EcoRV消化并去磷酸化的LITMUS28载体上，DNA片端通过快速连接程序连接并转化。载体:2µl(50ng)插入片段(3:1):1.7µl(103ng)水:6.3µl2XQuickLigationBuffer:10µlQuickT4DNA连接酶:1µl结果(转化子/µg):对照质粒(未切割)1.1X107不含插入片段的载体5.0X103载体+插入片段1.4X105Linker的连接：用50-250ng平滑末端DNA和20倍过量的Linker通过快速连接程序进行该实验。如果需要，可以按比例调整该程序以进行大批量DNA连接。示例：通过快速连接程序，将经EcoRV消化并去磷酸化的LITMUS28载体与包含有HindIII酶切位点的Linker(8bp)相连。连接产物纯化后，HindIII消化，然后再纯化并用快速连接程序环化。载体:6.7µl(1µg)Linkers(20:1):3.5µl(20pmols)水:34.8µl2XQuickLigationBuffer:50µlQuickT4DNA连接酶:5µl结果(转化子/µg):对照质粒(未切割)6.2X106不含linkers的载体3.0X103HindIII切割的载体3.9X106载体+linkers2.0X105末端摩尔浓度的计算：摩尔浓度=[(µg/µl)÷(碱基对×650道尔顿)]×2个末端举例：计算一个浓度为250ng/µl的5kb线性化载体的末端摩尔浓度：[(0.25µg/µl)÷(5000X650daltons)]X2=154nM如果将50ng这个载体加入到20µl连接反?µ逑抵校?偌扑隳┒四Χ?ǘ龋?50ng÷20µl=0.0025µg/µl[(0.0025µg/µl)÷(5000X650)]X2=1.54nM要达到3:1的插入片段：载体比例，计算一下需加多少1kb的插入片段：3X1.54nM=4.62nM[(?µg/µl)÷(1000X650)]X2=4.62nM0.0015µg/µlX20µl=0.03µg=30ng这个反应处在1-10µg/ml的最适范围内吗？(50ngvector+30nginsert)÷20µl=4µg/ml
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NEB
用户2、快速连接试剂盒常见问题及解答Q1:在应用快速连接试剂盒时，什么原因可以造成不完全连接或转化？A1:可能的原因有：快速连接反应被热失活了。快速连接缓冲液中含有PEG，热失活后会抑制转化。快速连接混合液在电击之前没有纯化。快速连接缓冲液中含有的PEG会阻止电击反应。可以应用商业化的DNA纯化柱纯化连接产物。过夜孵育进行连接反应。连接时间过长，快速连接缓冲液中存在的PEG就会降低转化效率。连接反应时间超过30min，也不会获得更好的效果。反应体系中盐浓度过高，抑制了连接或转化反应。可以纯化一下DNA。脱磷之后，所用的磷酸酶（CIP，BAP或SAP）没有完全失活或去除。可以按照推荐的操作来进行以去除磷酸酶或者选用热敏磷酸酶（NEB#M0289）。因为热敏磷酸酶在65℃5min即可完全失活而无需纯化DNA。另外一些影响因素：缓冲液超过一年，其中的ATP已经降解。补加新鲜的ATP至终浓度为1mM。DNA浓度过高，连接产物只有线性分子。建议总DNA浓度在1-10μg/ml之间。插入片段和载体没有磷酸基团。感受态细胞中加入的连接反应混合物过多。建议用量：50μl感受态细胞中加入1-5μl混合物。插入片段长度超过10kb，反应条件无法满足环化要求。可以降低插入片段浓度。限制性内切酶切割不完全。当用于PCR产物末端的切割时，建议在两端的酶切位点上加至少6个保护碱基。限制性内切酶没有完全热失活。如果选用的内切酶不能被热失活可以用酚/乙醇纯化DNA。内切酶消化过程中存在星活性，造成载体或插入片段的非特异性切割。可以通过凝胶电泳检测。如果出现一些多余的条带，应减少酶切过程中的酶用量或缩短反应时间。Q2:为什么转化会失败，可以进行哪些对照实验？A2:a.细胞已死或者并不是感受态。如果必要重新更换细胞，进行下述对照实验（i-iv）。重组蛋白在E.coli中不兼容。可以利用pMAL系统（NEB#E8000S）将其与麦芽糖结合蛋白进行融合表达。另外也可以换成E.coli之外的表达系统。连接后的DNA中含有纵列的倒置重复序列，E.coli无法识别。如果可以，去除重复序列。或换成E.coli之外的表达系统。注意：每一个对照实验应选用相同的DNA浓度，通常每个转化的用量为0.1-1ng.用没有切割的载体检测细胞活性以及质粒的抗性。在有抗性和没有抗性的平板上进行检测。切割后的载体不要进行连接：以检测未切割的载体。可以利用胶纯化来去除残余的0.1%的未切割的载体。将质粒（无插入片段）切割后进行再连接以检测连接活性以及DNA末端的完整性。对于没有切割过的质粒，应该有60-70%可以再连接.切割，脱磷，然后连接质粒用于检测由于不完全脱磷引起的背景。对于没有切割的质粒应该<3%.Q3:快速连接试剂盒中提供的T4DNA连接酶的浓度是多少？A3:2,000,000units/ml.与NEB高浓度T4DNA连接酶（NEB#M0202）相同。Q4:普通的T4DNA连接酶可以用快速连接缓冲液吗？A4：当用于普通T4DNA连接酶时，应将反应时间延长至15分钟。但是建议孵育时间不要超过30分钟。
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xiao1988qing
用户请问，我的基因片段2200bp,两端都是BamH1粘性末端，载体长9500bp,两端也都是该酶切位点，若用NEB的连接酶，常温连接，效率会怎样？转化呢？
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NEB
用户xiao1988qing请问，我的基因片段2200bp,两端都是BamH1粘性末端，载体长9500bp,两端也都是该酶切位点，若用NEB的连接酶，常温连接，效率会怎样？转化呢？xiao1988qing您好！首先，您是用BamHI进行单酶切，载体切割一定要完全，否则转化后会长的都是载体；建议您要对载体进行去磷酸化反应，如果不做去磷酸化，可能会载体自连几率特别高，影响插入片段连接的效率；其次，连接时，建议您按照上述的连接反应建议的条件进行，因为您的插入片段和载体都比较大，可能是不是很好连，所以要把注意事项都考虑到；如果可以的话，用高浓度的T4DNA连接酶进行连接，增大连接的效率；再次，转化时，因为这种大于10kb的片段比较难转化，如果可以的话，最好是能够用电击的方式，这样能够提高转化效率建议您阅读上述的连接酶相关问题，并结合自己的实验进行优化，常温连接时注意是室温（20-25度），如果是连接酶，那么建议是4小时以内，如果是快速连接试剂盒，那么建议最好是5分钟。
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钢铁苍穹
用户LZ你好，我有一个实验设计的，是同时把两段片段连接入载体。载体是pET15b，用NdeI和BamHI酶切。而两个片段，A片段长2.4Kb，用NdeI和KpnI酶切，短片段B长200bp，用KpnI和BamHI酶切。然后酶切好的载体和两个片段一起加入T4连接酶连接。请问三个片段的比例多少为好，T4酶的用量和连接温度时间多少为好呢？
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xiao1988qing
用户非常谢谢您的解答！载体片段的话，我已经去磷酸化了。想在片段浓度和酶浓度上再试试。
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NEB
用户展开引用钢铁苍穹LZ你好，我有一个实验设计的，是同时把两段片段连接入载体。载体是pET15b，用NdeI和BamHI酶切。而两个片段，A片段长2.4Kb，用NdeI和KpnI酶切，短片段B长200bp，用KpnI和BamHI酶切。然后酶切好的载体和两个片段一起加入T4连接酶连接。请问三个片段的比例多少为好，T4酶的用量和连接温度时间多少为好呢？......钢铁苍穹您好！同时连接两个片段效率会比较低，建议您为了试验的顺利，最好还是分步连接。
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钢铁苍穹
用户NEB钢铁苍穹您好！同时连接两个片段效率会比较低，建议您为了试验的顺利，最好还是分步连接。你好，请问分步连接的话，先把大片段和载体连接还是把小片段和载体连接效率比较高呢？第一次的连接产物需要经过纯化再进行第二次连接么？谢谢
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NEB
用户钢铁苍穹你好，请问分步连接的话，先把大片段和载体连接还是把小片段和载体连接效率比较高呢？第一次的连接产物需要经过纯化再进行第二次连接么？谢谢钢铁苍穹您好！建议您最好是先连好一个载体，然后以插入片段的载体为底物再进行另外一个片段的连接，而不是先连接，纯化再连接这样的步骤。至于先连接大片段还是小片段，主要是根据您的载体的大小，因为您的载体并不是特别的大，考虑可能您先连接小片段会更好一些。
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xiao1988qing
用户想请问，用T4连接酶连接时，20ul体系中，除了要注意载体+插入片段终总浓度为1-10ug/ml以外，如果要增加酶的量，buffer是否也要相应增加，也就是两者体积是否必须呈一定比例？
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NEB
用户xiao1988qing想请问，用T4连接酶连接时，20ul体系中，除了要注意载体+插入片段终总浓度为1-10ug/ml以外，如果要增加酶的量，buffer是否也要相应增加，也就是两者体积是否必须呈一定比例？xiao1988qing您好！Buffer都是1X的，如果您是10ul体系，那么Buffer加1ul，如果是20ul体系，那么Buffer加2ul，与酶之间没有特别的联系；一般情况下，20ul体系中加1ulT4DNA连接酶，如果您多加酶的话，最多不能超过反应总体系的十分之一；
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xiao1988qing
用户非常感谢楼主！
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nsdyz
用户你好。我在实验中用的是m0202sT4连接酶。因为我要连接的片段大约100bp,载体是7000bp。所以在计算它们的加入量的时候非常悬殊，看到您上边的建议的DNA总浓度为1-10ug/ml,那么反应体系10ul的话，片段要加入的量是很小的，这样可以吗？
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luch75
用户这个贴子好，官方资料
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hedyzero
用户楼主好哈！你上面提到电转化前，连接产物必须纯化，推荐“柱离心式DNA纯化方法”，请问这个是专门的试剂盒吗？大家常说的3M醋酸钠和乙醇沉淀可以吗？电转一直没成功，没纯化和纯化的连接产物都试过了，但是结果都是没菌落
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hedyzero
用户电转时2mm的电转杯，感受态和连接产物分别加多少量比较合适？
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NEB
用户hedyzero楼主好哈！你上面提到电转化前，连接产物必须纯化，推荐“柱离心式DNA纯化方法”，请问这个是专门的试剂盒吗？大家常说的3M醋酸钠和乙醇沉淀可以吗？hedyzero你好纯化的目的主要是去除PEG，不建议使用3M醋酸钠和乙醇沉淀方法。
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diaomou
用户为什么一边说总DNA浓度低于10微克每毫升，另一边在说明书上又说推荐DNA浓度：0.1-1微mol每升？
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天高云淡dxy
用户想请教一下，我最近在构建载体，想将一个约1000bp的片段，连接到pCDNA3.1上，步骤如下：加了酶切位点（BamH1/EcoR1)的目的片段已经连接至pMD19T上，用BamH1/EcoR1双酶切T载和pCDNA3.1，胶回收目的片段和载体，ddH2O洗脱，用NEBT4连接酶连接（货号M0202S），连接体系：2ul载体（约5400bp)（30ng/ul),6ul目的片段（1000bp),(15ng/ul)，1ul10*Buffer,1ulT4ligase。16℃，2h，或者过夜。第二天转化，感受态是DH5α，10ul连接产物加到110ul感受态中，冰浴30min,42℃热击90s,冰浴3min,900ulSOC复苏1h~2h,涂板子，Amp抗性。结果板子一直空空如也，什么都不长。求解救。
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wangyinyuea
用户我想问一下，我是用Hind3和Ecor1双酶切，连接的，用T4DNA连接酶M0202，最少可以用多长时间连接，而且可以保证连接的质量，实验室都是过夜连接的，但我有点着急，必须要过夜才行吗？
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westernbiotec
用户T4DNALigase可以试试西恩的WEE003，室温5分钟就好，不需要低温过夜
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世纪同乐
用户想请问楼主，用goldengate法插入20bp左右的小片段，看到文献有将酶切和连接反应在同一体系中完成的，这种方法效率如何，实验室是tangobuffe（赛末飞）不知道补ATP后NEB的t4连接酶是否兼容，如果可行，是否需要选择高浓度酶。先谢过了
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