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3.6.1 用 T4 DNA连接酶连接RNA分子一用 T4 DNA连接酶连接RNA分子
来自 : 蚂蚁淘
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一材料与设备

1)T4DNA连接酶

2)T4多聚核酸激酶

3)RNA供体

4)受体

5)寡核苷酸cDNA模板

6)10X连接缓冲液:500mmol/LTris-HCl(pH7.5),100mmol/LMgCl2,200mmol/LDTT,0.5mg/mLBSA(适用NewEngtandBiolabs连接酶)或660mmol/LTris-HCl(pH7.6),66mmol/LMgCl2,lOOmmol/LDTT(适用于Amersham/USB连接酶)

                                   


7)[Y32P]ATP(10mCi/ml,300Ci/mmol=3.33umol/L)

8)无RNase水

9)l0mmol/LATP

10)RNasin。

11)无RNase的DNase。

12)真空离心浓缩仪。

13)5XTBE:54gTris,27.5g硼酸,20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)

14)2X变性胶上样缓冲液:10mol/L尿素,1XTBE或80%甲醛,1XTBE

15)TE;10mmol/LTris-HCl(pH8.0),lmmol/LEDTA


二、操作方法

1.磷酸化3'RNA

1)在1.5ml管中加入5ul[γ32P]ATP(50ulCi,16pmol),用真空离心浓缩仪干燥。

2)在此管中加入:0.5ul10X连接缓冲液,3ul20umol/L3'RNA,1ul水,0.5ulT4多核苷酸激酶,终体积为5.0ul

3)于37℃:孵育30〜60min

4)于75°C孵育l0min或92〜95℃孵育2min,灭活多核苷酸激酶。置于冰上

2.连接反应

1)在灭活的多核苷酸激酶反应管中,加1.0ul10×连接缓冲液.3.0ul20umol/L5'RNA,3ul20umol/LcDXA模板。

2)加热至75℃2min再室温放置5min,杂交RNA与DNA。

3)在杂交反应液中加入1.l0mmol/L冷ATP,2ulT4DNA连接酶,至终体积15ul

4)于30°C孵育2〜4h。

5)加lul无RNase的DNase,于37℃孵育15〜30min

6)加16ul2X上样缓冲液,上样电泳,可以检测到标记的5'RNA与3'RNA以及相成于连接产物的全长分子。
注意事项
对于有效的连接,桥梁cDNA模板的浓度非常重要,最好等于或介于两种待连接的RNA分子的浓度之间,如模板过量,RNA分子就会与不同的cDNA模板结合,而无法同另意RNA分子结合。我们建议连接反应中RNA的浓度最好为0.1〜10umol/L
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