【原创】CRISPR/Cas9制作基因敲除和基因敲入大小鼠的一些经验分享
2021-09-14
问题描述:
传统的条件性敲除
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
传统方法,首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列,这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
第二步,通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。在细胞水平上,可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞,通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除;在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交,筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。将Cre基因置于可诱导的启动子控制下,通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除(诱导性基因敲除),实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。
一般需要一年以上的时间,价格在15-20万不等。
基于Cas9系统的条件性敲除
原理上和传统的条件性敲除类似,差别在于利用OptimizedCas9/CRISPRSystem(OCAS)技术在基因组上加入loxp序列,可以快速获得Loxp位点插入的小鼠。
一般只需要4-5个月。价格也比传统方法大大降低。
五、如何制作基因敲除小鼠
因为技术和仪器的缺陷,一般实验室都不太会做到这一步。
mark先定格框架慢慢写
还开了另外一个帖子讲Cas9技术本身及在细胞生物学上的应用。也欢迎交流。
Cas9基因敲除技术详述-蚂蚁淘论坛
大家都知道Cas9很火,用于Genomeediting非常方便。本文主要是回顾一下发现历程、分享一些在制作基因敲除细胞系、基因敲除小鼠和最近做GenomewideCas9筛选过程中的一些心得体会。
一、Cas9简介
二、如何设计gRNA
三、如何快速克隆gRNA
四、如何制作基因敲除、基因敲入和条件性敲除
A
B
C条件性敲除
目前的条件性敲除小鼠主要是基于Cre-LoxP系统的。Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
传统的条件性敲除
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
传统方法,首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列,这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
第二步,通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。在细胞水平上,可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞,通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除;在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交,筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。将Cre基因置于可诱导的启动子控制下,通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除(诱导性基因敲除),实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。
一般需要一年以上的时间,价格在15-20万不等。
基于Cas9系统的条件性敲除
原理上和传统的条件性敲除类似,差别在于利用OptimizedCas9/CRISPRSystem(OCAS)技术在基因组上加入loxp序列,可以快速获得Loxp位点插入的小鼠。
一般只需要4-5个月。价格也比传统方法大大降低。
五、如何制作基因敲除小鼠
因为技术和仪器的缺陷,一般实验室都不太会做到这一步。
mark先定格框架慢慢写
还开了另外一个帖子讲Cas9技术本身及在细胞生物学上的应用。也欢迎交流。
Cas9基因敲除技术详述-蚂蚁淘论坛
*请输入10-500个字符
已帮助
0人
0人
tk57ml
用户
鼓励原创,欢迎讨论
已帮助
0人
0人
chenchanchan
用户
非常有用,请继续!
已帮助
0人
0人
mqc1989220
用户
支持原创!
已帮助
0人
0人
raulcoco
用户
关注这项技术~
已帮助
0人
0人
wyhauannng
用户
这项技术简直太有用了,很高效啊
已帮助
0人
0人
w191794671
用户
基因敲入呢?
已帮助
0人
0人
lianyu929
用户
CRISPR/Cas9基因敲除---丁香通技术服务
已帮助
0人
0人
13xbd
用户
虽然没做过可以看看
▍
相关分类
▍
相关文章
漩涡振荡器快速混匀器的用途和工作原理
跪求国内外生产LED硅胶企业_
BIOCYTE_
null中文_null是什么意思 ichacha.net
赛业十周年【压轴巨献】:基因敲除3.8万,基因敲入5.8万 ...
洗板机_品牌/价格/供应厂家3618医疗器械网
福彩双色球20059期钢牙杀一红 58对49天齐网
几种高温DNA聚合酶性质比较+文献综述(4)_毕业论文 lwfree.cn
Shimpack Velox 实心核颗粒色谱柱 | 岛津(上海)实验器材 ...
第三届(2010)中国油脂化工行业年会在昆明召开_协会新闻 ...
Gefitinib (ZD1839) | EGFR 抑制剂 | 现货供应 | 美国品牌 Selleck
人低氧诱导因子1α(HIF1α)ELISA试剂盒上海_
▍
相关问答