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做黄单胞,在通过Tn5构建转化子库之后,通过致病力筛选、Tail-PCR获得侧翼序列、比对获得全基因之后,将几个可能与致病力相关的基因做了敲除,现在正在构建互补载体,已经做了敲除转化子的胞外酶活性测定、胞外多糖分泌测定、生长曲线、致病性测定等等,不过不知道将互补做完了之后还有什么可以做的。通过敲除来研究基因的功能,所谓的敲除不外乎有三种情况:1)单交换插入抗性基因使原基因失活;2)抗性基因双交换替换掉原基因;3)同框缺失即完整的使原基因敲除掉。第三种情况得到的突变株比较好但筛选工作量很大,前两种情况因为插入了抗性基因比较好筛选突变子,但是由于外源的插入了抗性基因容易引起polar effect,所以拿到突变株后要做回补实验来排除是由polar effect引起的,如果是第三种情况得到的突变株不做回补也没关系,做了会更好。
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