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2018-03-20
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的CRISPR/Cas9 Validated PLA2G12A sgRNA; 基因敲除sgRNA供应信息，浏览与CRISPR/Cas9 Validated PLA2G12A sgRNA; 基因敲除sgRNA相关的产品或在搜索更多与CRISPR/Cas9 Validated PLA2G12A sgRNA; 基因敲除sgRNA相关的内容。 查看更多
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2021-09-14
围绕疾病所开展的基础研究离不开模式动物，利用基因工程技术建立的动物模型是研究疾病机制及诊治的重要手段，也是基础医学研究和转化医学研究的重要桥梁。赛业作为规模庞大的转基因/基因敲除模式动物商业技术平台，历经十多年的发展，已服务数千客户，学术引用累计超过1300篇，是目前国际上最主要、最被认可的基因工程模式动物商业服务平台之一。在基因工程模式动物领域数年不懈的耕耘，让赛业积累了丰富的模式动物制备经验，也获得了... 查看更多
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2021-09-08
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的POGK Knockout HeLa Cell Line; POGK 基因敲除细胞-CRISPR供应信息，浏览与POGK Knockout HeLa Cell Line; POGK 基因敲除细胞-CRISPR相关的产品或在搜索更多与POGK Knockout HeLa Cell Line; POGK 基因敲除细胞-CRISPR相关的内容。 查看更多
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2018-06-02
细胞、细菌内基因的定点敲除、敲入 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，其中 II型 CRISPR/Cas免疫系统依赖 Cas9内切酶家族靶向和剪切外源 DNA。在这一系统中， crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-ac... 查看更多
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上海邦耀生物科技有限公司在发布的基因敲除和点突变大小鼠供应信息，浏览与基因敲除和点突变大小鼠相关的产品或在搜索更多与基因敲除和点突变大小鼠相关的内容。 查看更多
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2017-11-01
Crispr基因敲除细胞系构建主要实验项目服务 序号 服务项目 具体描述 单价(元) 实验周期 备注 2 Crispr引物设计 每个基因设计2-3对引物 300 4天 包含引物设计、合成费用 3 gRNA质粒构建 一对 查看更多
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2021-08-26
货号：M20301-0500 查看更多
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2021-08-22
百奥迈科生物技术有限公司在发布的Precut pSG-target Cloning kit & SSA assay （CRISPR/Cas9 基因敲除技术）供应信息，浏览与Precut pSG-target Cloning kit & SSA assay （CRISPR/Cas9 基因敲除技术）相关的产品或在搜索更多与Precut pSG-target Cloning kit & SSA assay （CRISPR/Cas9 基因敲除 查看更多
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2018-02-13
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的CRISPR/Cas9 Validated SLC25A32 sgRNA; 基因敲除sgRNA供应信息，浏览与CRISPR/Cas9 Validated SLC25A32 sgRNA; 基因敲除sgRNA相关的产品或在搜索更多与CRISPR/Cas9 Validated SLC25A32 sgRNA; 基因敲除sgRNA相关的内容。 查看更多
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2021-07-22
北京京雷科技发展有限公司在发布的CRISPR/Cas9系统基因敲除细胞系建立供应信息，浏览与CRISPR/Cas9系统基因敲除细胞系建立相关的产品或在搜索更多与CRISPR/Cas9系统基因敲除细胞系建立相关的内容。 查看更多
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2021-09-21
江苏锐阳生物科技有限公司是大肠杆菌基因敲除技术服务商之一，从事大肠杆菌基因敲除已经多年。同时，生物在线为您提供众多企业大肠杆菌基因敲除技术服务，您可以搜索更多相关的大肠杆菌基因敲除实验技术服务，以便挑选到性价比高，合适的大肠杆菌基因敲除产品。而生物在线将会为您在大肠杆菌基因敲除方面提供全方位的解决方案。 查看更多
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2021-07-21
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的EGFR Knockout HeLa Cell Line; EGFR 基因敲除细胞-CRISPR供应信息，浏览与EGFR Knockout HeLa Cell Line; EGFR 基因敲除细胞-CRISPR相关的产品或在搜索更多与EGFR Knockout HeLa Cell Line; EGFR 基因敲除细胞-CRISPR相关的内容。 查看更多
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有人用CRISPR/Cas9系统做细胞基因敲除吗交流下 分子生物...123
阿瑟58342021-08-20
基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。分为完全基因敲除和条件基因敲除。
基因敲除技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，自身发展的同时也促进了相关技术的进一步发展。流程大概是这样的：首先获得小鼠ES细胞系，测试ES细胞嵌合入受体囊胚的能力之后根据不同基因、不同目的设计并构建打靶载体，将打靶载体转入一定数目ES细胞中，然后鉴定出带有发生正确同源重组的突变中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，是的经过修饰的遗传信息经生殖系遗传，从而得到带有修饰基因的突变小鼠，而后可以对其进行表型分析。
目前，在ES细胞中进行同源重组已经成为一种研究特定基因甚至基因的特定结构域和对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。1997年通过基因打靶获得的突变小鼠就已经超过千种，近年来随着基因敲除技术的不断进步，尤其是DNA重组技术和小鼠基因组测序的完成，使得建立基因敲除小鼠的周期大大减少，使基因敲除小鼠数目大大增加。各国也都建立了突变体小鼠及转基因小鼠的数据库。
06年8月七日，美国国立卫生研究院宣布将投巨资启动敲除小鼠基因组计划，目的是建立一个完善、免费的小鼠基因组突变基因数据库，研究人员可以利用基因敲除小鼠研发能为治疗癌症、心脏病、神经退行性疾病、糖尿病等人类遗传疾病提供更为优秀的动物模型。展开
基因敲除技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，自身发展的同时也促进了相关技术的进一步发展。流程大概是这样的：首先获得小鼠ES细胞系，测试ES细胞嵌合入受体囊胚的能力之后根据不同基因、不同目的设计并构建打靶载体，将打靶载体转入一定数目ES细胞中，然后鉴定出带有发生正确同源重组的突变中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，是的经过修饰的遗传信息经生殖系遗传，从而得到带有修饰基因的突变小鼠，而后可以对其进行表型分析。
目前，在ES细胞中进行同源重组已经成为一种研究特定基因甚至基因的特定结构域和对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。1997年通过基因打靶获得的突变小鼠就已经超过千种，近年来随着基因敲除技术的不断进步，尤其是DNA重组技术和小鼠基因组测序的完成，使得建立基因敲除小鼠的周期大大减少，使基因敲除小鼠数目大大增加。各国也都建立了突变体小鼠及转基因小鼠的数据库。
06年8月七日，美国国立卫生研究院宣布将投巨资启动敲除小鼠基因组计划，目的是建立一个完善、免费的小鼠基因组突变基因数据库，研究人员可以利用基因敲除小鼠研发能为治疗癌症、心脏病、神经退行性疾病、糖尿病等人类遗传疾病提供更为优秀的动物模型。展开
酿酒酵母做crispr基因敲入donor dna加多少123
韩晓柒37592021-09-11
利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
哪里可以利用CRISPR/Cas9基因敲除细胞,可以参与进行吗？_123
dxy_221lk3d82021-07-30
本人最近打算准备利用crisprcas9技术敲除老鼠细胞的基因，但是感觉问题好多呀，首先，我找到两条这个基因的CDNA序列，但是这两条序列不一样，只有89%的同源性，请问这应该怎么破？有没有大神可以指导一下啊？
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（7）验证敲除WB123
维尼00942021-09-10
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。
crispr dcas9怎么同时激活和转录123
猴79825期陡2021-08-30
“基因敲除狗”，“基因敲除猪”，CRISPR/Cas9到底是怎样一个技术技术近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗？杜德娜和艾曼纽？夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。二、CRISPR/Cas系统的灵感来源CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。1、“记录”入侵者档案其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图A所示）。图1 CRISPR序列示意图其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。2、打击二次入侵者当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。三、CRISPR/Cas9技术的实现需要什么？在CRISPR/Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，如图3所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游展开
基因组编辑三大利器:TALEN、ZFN和CRISPR/Cas9 | 赛业生物123
周效华2021-09-09
从2011年科学家实现TALEN技术，2013年科学家实现CRISPR/Cas9技术，这些技术的迅速成熟都给基础生物学研究、临床医学研究提供了更为方便和快捷的分子生物学工具。技术进步必将在未来给科学研究及基因治疗研究带来更为广泛的发力！这在2014年以来的频频出现的Cas9技术在各个领域的应用进展中可以清晰看到。欢迎感兴趣的朋友联系我交流这些方面的进展。
关于这些技术的具体原理和操作细节，请查看我之前的帖子附件详细介绍，TALEN，CRISPER/Cas9技术做基因敲除技术资料-蚂蚁淘论坛。不清楚的请联系我咨询。此贴主要谈一谈在用这些技术进行癌细胞株阳性细胞克隆筛选的过程中，如何进行阳性克隆筛选，为初次接触这些新技术的研究者提供一些参考意见。
一般CRISPER-Cas9质粒转染后，采用有限稀释法接种到96孔板中长克隆，待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时，显微镜下仔细观察每一个孔的细胞，若发现非单克隆的细胞需要将其标注出来剔除筛选之外。传两代后，取出单个克隆的一部分细胞提取基因组DNA。
分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物，并从提取的基因组中扩出目的片段，然后选择部分阳性克隆进行PCR产物或做T载克隆送测序进行最终确认。
目前推崇的各种识别错配碱基的酶切鉴定方法及Surveyorassay试剂盒由于假阳性过高及过于昂贵，一般实验室我们不建议使用。少数试剂酶公司对于酶的推荐有利益因素驱动，希望各位战友注意甄别，土豪请忽略。(*^__^*)
运用CRISPER-Cas9技术进行癌细胞系的基因敲除，我们的经验是若设计的CRISPER-Cas9载体表达水平够高，敲除效率够高，此步骤多数时候可以直接省略。
详细的Protocol这里给出sigma最早ZFN的protocol，请查阅附件。这份protocol很经典，各位战友可以参考认真阅读一下。其他注意点如下，供参考。欢迎战友们补充。
建议一三事：(土豪别忽略)
1.土豪购买Surveyorassay的kit链接:
http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/surveyor-mutation-detection-kits
2.转染的时候就按照转染试剂推荐的DNA用量转染就可以。目前有Cas9和gRNA分别在两个不同的载体上的，也有在同一个载体上的，两个载体上的那套体系，建议转染时质粒DNA用量摩尔比例1：1。
3.设计上下游引物时，PCR产物的大小最好是四五百bp长比较合适，gRNA的targeting位点并不需要正好在PCR产物的中间。
4.做surveyorassay时用的PCRmix我们就是用的Sigma的JumpStartReadyMix，这个是热启动的Taq酶，mix里面没有DNA染料，可以直接用于surveyorassay。
5.分完96孔板之后大概一个星期能长出大小比较合适的单克隆，因为分细胞的时候不能保证完全均匀，有的孔里可能会长出2个或更多细胞克隆，所以需要在显微镜下把有多个克隆的孔剔除掉。我们习惯将96孔板里的单克隆消化下来再转到一个新的96孔板里，长满之后1/4-1/5再传代，剩下的细胞裂解之后提基因组DNA做surveyorassay。挑克隆鉴定的工作量比较大。
6.5中的两次传代目的是为了去除掉细胞培养基及细胞内的参与相关CRISPER-Cas9载体，以免形成二次切割，所获得的克隆不纯。建议最好要做这样一部操作。
7.更多详细的实验细节操作，欢迎联系我咨询或仔细阅读附件中的文件。
此贴若对您实验有帮助，记得常回来踩踩，道声感谢，给个力赞、怒赞啥的，鄙人不图其他，图个能帮助到更多的蚂蚁淘的战友们。也欢迎跟帖提问。我不定期回答大家的疑问。欢迎分享、转发、收藏给您的好友、同事、同学及***等。好东西请别自己独自藏着掖着。
预祝您实验顺利！
这个部分的PS也很重要，希望能够引起，特别是土豪们的注意。那就是关于癌细胞株用来从事科学研究之我见，供参考。欢迎战友们补充。土豪我们做朋友吧。嘻嘻！
PS一三事：（土豪请重视）
1.在癌细胞系上做基因敲除，科学家有此想法由来已久。HGP后，科学家能够读取基因信息，RNAi现象的发现被很快开发并运用到基因的敲低工作中来，虽然不能达到彻底敲除的目的，但至少在那个时代，在各方面数据及对照做足的情况下，给科学进步确实带来了很大帮助。
2.做过癌细胞株染色体相关的工作的科学家一定看过或者一定知道癌基因组的Variety是非常大的，很多时候对门实验室养的Hela细胞或者293T细胞和自己养的情况都不一定一样。染色体的各种缺失、多拷贝、异位、反转等等情况时有发现及发生，也不断在癌化当中。
3.针对2中的考虑，如果我们所研究的基因恰恰与癌细胞株的种种变异相关上，在此癌细胞株上做基因敲除就会有各种风险，土豪们需要额外注意选择一个合适的细胞系可能很关键。
4.所感兴趣基因的功能对于癌细胞本身的生长等是否会造成影响，这点的风险其实对于做基因敲除来讲也是存在的，虽然一般不会有大的影响。
5.根据我们的经验，至少CRISPER-Cas9技术基因敲除细胞系获得杂合子敲除（包含三整倍数aa的缺失或插入）阳性细胞克隆的获得概率约为10%；纯合子获得概率约为30%。不同基因情况不同，数据仅供参考，有时或高或低。
6.如果一次很难获得基因敲除纯合子的癌细胞克隆，癌细胞无法实现小鼠繁育类似的杂合子间交配获得纯合子，只能再次转染筛选。
7.不管是癌细胞培养还是RNAi技术（主要指shRNA），都是在一定的特殊历史时期或者科学家经费有限情况下的特殊时期的“无奈”选择。那个年代获得基因修饰动物及饲养动物成本要肯定远远比培养细胞高多了。
8.RNAi技术所在的一个特殊历史阶段，科学家无法很快及较低成本做到细胞系或小鼠个体水皮上的彻底敲除，只能退而求其次，实现在细胞或小鼠上敲低，再辅以其他数据与严格对着呼应。
9.如果土豪您有能力，请告诉我们您的心声，截止2014年获得CRISPER-Cas9基因敲除、基因敲入、基因条件性敲除、多基因、基因大片段（如两个，三个、甚至更多）敲除的小鼠获得的周期及成本越来越低。
10.动物水平实验研究的意义要远远超过细胞株实验的意义，这点自不必说。但细胞株实验的较高通量来筛选候选基因也有其固有的优势。
11.从整个细胞株建系周期及成本上看，和基因敲除动物相比，彼此彼此，没有绝对的优势。
CRISPER-Cas9技术筛选基因敲除细胞系阳性克隆Protocol-上海南方模式生物研究中心.pdf(310.12k)
CompoZrCustomZincFingerNuclease(ZFN)TechnicalBulletin-GenomeEditingProtocol.pdf(817.12k)
大肠杆菌CRISPRCas9系统基因敲除简介123
__堶__2017-10-29
1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
CRISPR/Cas9 系统的应用_基因123
互撸娃_庞诟42021-09-03
基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。向左转|向右转
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。向左转|向右转
CRISPCas系统介导的基因编辑技术论文123
ni林T373522021-08-01
近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。
crisprcas9精细原理:基因敲除、点突变、基因插入讲解学习_...123
黑葱TA00012021-07-25
十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为 CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为 DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用 CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系）。就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道 Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。
CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。
将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与 Cas 形成复合物，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。
“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。
不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。
近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。
如何 CRISPR 我的靶标？
由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。
CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。
将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与 Cas 形成复合物，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。
“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。
不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。
近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。
如何 CRISPR 我的靶标？
由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。
CRISPR/cas系统敲除后,如何筛选???_问答详情_CRISPR基因敲除_...123
lwq6522021-08-02
我想问一个基础问题啊，用CRISPR/cas系统敲除某个基因后，如果突变株表型没法通过肉眼分辨，怎么把突变株找出来？要用到什么Marker吗？还是需要对细胞逐个测序检测？
如果是逐个检测，那就涉及到效率问题了，当效率比较低的时候，岂不是工作量很大？
还有cas9基因会残留在细胞里吗？
CRISPR/Cas9 系统目前的研究热点有哪些方面?123
TASG13072017-10-02
1.什么是CRISPR/Cas9？
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的
CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。是细菌的一种获得性免疫系统。
Cas----CRISPR-associated
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系统分为Type I、TypeII 、Type III三种类型。在TypeII
系统中包含一个标志性的Cas9蛋白（参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合
体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的优缺点
优点：
构建方便简单快捷
高效的介导基因定点敲入和基因组的点突变
精确的切口酶活性提高了基因治疗的安全性
缺点：
严重的脱靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶（前两代分别是ZFN和TALEN），用于复杂基因组的编辑，目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌的基因组精确修饰。
4.CRISPR/Cas9目前热点
CRISPR/Cas9有个极大的优势就是可以改造为切口酶，在DNA的特定位置制造单链切口，这样不会引起非同源末端连接，但是可以激活同源细胞的重组。
这套系统目前的主要用途是在以下几个方面：
基因定点InDel突变
基因定点敲入
两位点同时突变
小片段的缺失
编码基因和非编码基因（lncRNA、microRNA）的靶向基因敲除
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的
CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。是细菌的一种获得性免疫系统。
Cas----CRISPR-associated
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系统分为Type I、TypeII 、Type III三种类型。在TypeII
系统中包含一个标志性的Cas9蛋白（参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合
体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的优缺点
优点：
构建方便简单快捷
高效的介导基因定点敲入和基因组的点突变
精确的切口酶活性提高了基因治疗的安全性
缺点：
严重的脱靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶（前两代分别是ZFN和TALEN），用于复杂基因组的编辑，目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌的基因组精确修饰。
4.CRISPR/Cas9目前热点
CRISPR/Cas9有个极大的优势就是可以改造为切口酶，在DNA的特定位置制造单链切口，这样不会引起非同源末端连接，但是可以激活同源细胞的重组。
这套系统目前的主要用途是在以下几个方面：
基因定点InDel突变
基因定点敲入
两位点同时突变
小片段的缺失
编码基因和非编码基因（lncRNA、microRNA）的靶向基因敲除
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