StandardcloningforlargeinsertsandGibsonassemblyelectroporation
- Clonelargeinsertsandtransformlargeplasmids-uptoatleast145kbplasmidDNA.
- GeneratecloneswithinducIBLecopynumberusingCopyControl™vectors.
- Achievehightransformationefficiencies:>1×1010cfu/µgpUC19DNA.
- IncreaseGibsonAssembly®colonycountswithhigh-efficiencyelectroporation
Applications
- Generationofinduciblecopy-numberclonesusingtheCopyControl™CloningSystem.
TransforMax™EPI300™E.colicellslackthetonAgeneandareengineeredforusewithEpicentre'sCopyControl™CDNA,Gene,andPCRCloningKitandotherCopyControlCloningSystems*thatdonotrequirephageT1-resistantcells.ThecellscontainaninduciblemutanttrfAgenewhosegeneproductisrequiredforinitiationofreplicationfromtheoriVoriginofreplication,suchasthatinCopyControlpCC1™vectors.OnLBchloramphenicolplatesorinLBorSOCmediasupplementedwithchloramphenicol,CopyControlclonesgrowninTransforMaxEPI300E.colireplicateatsingle-copynumberfromtheF-factorrepliconbecauseexpressionofthetrfAgeneisrepressed.AdditionofCopyControlInductionSolutioninducesthecellstoexpressthetrfAgeneproductandinducestheirreplicationathigh-copynumberfromoriV(Fig.1).ReplicationfromoriVresultsinhigheryieldsandhigherpurityofclonedDNA. Benefits
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Figure1.CopynumberofCopyControl™BACclonescanbeinduced10-to20-foldinTransforMax™EPI300™E.coli.TheyieldofBACDNAfromCopyControlBACclonesof110-145kbincreased>14-foldfollowingadditionofCopyControlInductionSolution.U=uninducedcells;I=inducedcells. |
Genotype
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsL(StrR)nupGtrfAdhfr
TransforMaxEPI300ElectrocompetentE.coli
- Transformationefficiencyof>1x1010cfu/µgofpUC19.
TransforMaxEPI300ChemicallyCompetentE.coli
- Transformationefficiencyof>5x108cfu/µgofpUC19.
*Coveredbyissuedand/orpendingpatents.
ORDERINFORMATION
1,000Xconcentratedsolution.Filtersterilized.ebiomall.com
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http://www.nature.com/nature/journal/v520/n7546/full/nature14299.html
如果觉得答案解决了你的问题,请采纳,有问题可继续追问,如未回答追问,可能是不在哦
科学家发现,细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后,可以获得其部分DNA(脱氧核糖核酸)片段并整合进基因组形成记忆,当再次遭到入侵时,转录出相应的RNA(核糖核酸),利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR/Cas9技术就是利用这一原理,用一种定制的RNA引导Cas,对预设DNA位点进行切割,造成DNA断裂,启动细胞内基因组修复机制,实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
通过敲除来研究基因的功能,所谓的敲除不外乎有三种情况:1)单交换插入抗性基因使原基因失活;2)抗性基因双交换替换掉原基因;3)同框缺失即完整的使原基因敲除掉。
第三种情况得到的突变株比较好但筛选工作量很大,前两种情况因为插入了抗性基因比较好筛选突变子,但是由于外源的插入了抗性基因容易引起polar effect,所以拿到突变株后要做回补实验来排除是由polar effect引起的,如果是第三种情况得到的突变株不做回补也没关系,做了会更好。
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近年来,CRISPR/Cas9风暴席卷全球。这项基因组编辑技术在短短几年内迅速应用于世界各地的实验室,并催生了上千篇文章的发表。然而,麻省理工学院(MIT)的《Technology Review》杂志提出了一个问题,谁才是CRISPR技术的所有者?生物通 www.ebiotrade.com
一个月前,“科学突破奖”(Breakthrough Prize)揭晓。加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和德国亥姆霍兹传染研究中心的Emmanuelle Charpentier因在CRISPR技术方面的重要贡献而获奖,且每人获得了300万美元的奖金。
这一领域的另一位风云人物,Broad研究院的张锋(Feng Zhang)虽然没有获得科学突破奖,但在今年4月获得了CRISPR/Cas9的首个专利。他的研究中心控制着这一技术的每个重要商业应用。生物通 www.ebiotrade.com
那么问题来了,这个备受瞩目的奖项和专利为何会落入不同人的手中?究竟是谁发明了它?“这一领域的知识产权相当复杂,”CRISPR Therapeutics公司的CEO Rodger Novak谈道。Emmanuelle Charpentier是这家公司的创始人之一。
Tech Review的记者Antonio Regalado指出,张锋与Doudna共同创立了Editas Medicine公司,它获得了Broad的技术授权。不过,在张锋成功申请专利之后,Doudna就与该公司断绝了关系。她将她的知识产权(专利申请中)授予了另一家竞争性的公司Intellia Therapeutics。然而,让事情更加复杂的是,Charpentier又将她在同一专利申请中的权利出售给了CRISPR Therapeutics。生物通 www.ebiotrade.com
此外,围绕这一技术的科学信用,那也是错综复杂。2012年夏天,Doudna、Charpentier及她们的团队发表了一篇文章,证明CRISPR/Cas9系统可以作为一种可编程的DNA编辑工具。半年后,张锋博士以及哈佛大学的George Church发表文章称它可应用于人类细胞,不久后,Doudna也发表了类似的结果。
但是,张锋表示他对Doudna和Charpentier的工作知之甚少。为了支持他的专利申请,他提交了实验室笔记本的照片,表示他在2012年年初就开始了这方面的研究,早于Doudna和Charpentier。生物通 www.ebiotrade.com
Charpentier表示:“我可以说的是,我和Jennifer Doudna是在我的实验室中开展研究。这里的一切都很夸张,因为这是一项人们很容易学会的技术。事情发生得太快了。”
Regalado在文中写道:“目前还没有CRISPR药物。但是如果CRISPR真的如科学家想象得那么重要,对这一基本技术的商业控制将价值数十亿美元。”也许,这场专利之战才刚刚开始。(生物通 薄荷)
基因敲除技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上,自身发展的同时也促进了相关技术的进一步发展。流程大概是这样的:首先获得小鼠ES细胞系,测试ES细胞嵌合入受体囊胚的能力之后根据不同基因、不同目的设计并构建打靶载体,将打靶载体转入一定数目ES细胞中,然后鉴定出带有发生正确同源重组的突变中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞可以发育为嵌合体动物的生殖细胞,是的经过修饰的遗传信息经生殖系遗传,从而得到带有修饰基因的突变小鼠,而后可以对其进行表型分析。
目前,在ES细胞中进行同源重组已经成为一种研究特定基因甚至基因的特定结构域和对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。1997年通过基因打靶获得的突变小鼠就已经超过千种,近年来随着基因敲除技术的不断进步,尤其是DNA重组技术和小鼠基因组测序的完成,使得建立基因敲除小鼠的周期大大减少,使基因敲除小鼠数目大大增加。各国也都建立了突变体小鼠及转基因小鼠的数据库。
06年8月七日,美国国立卫生研究院宣布将投巨资启动敲除小鼠基因组计划,目的是建立一个完善、免费的小鼠基因组突变基因数据库,研究人员可以利用基因敲除小鼠研发能为治疗癌症、心脏病、神经退行性疾病、糖尿病等人类遗传疾病提供更为优秀的动物模型。展开
CRISPR derived RNA
就是用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统衍生的RNA。
从2011年科学家实现TALEN技术,2013年科学家实现CRISPR/Cas9技术,这些技术的迅速成熟都给基础生物学研究、临床医学研究提供了更为方便和快捷的分子生物学工具。技术进步必将在未来给科学研究及基因治疗研究带来更为广泛的发力!这在2014年以来的频频出现的Cas9技术在各个领域的应用进展中可以清晰看到。欢迎感兴趣的朋友联系我交流这些方面的进展。
关于这些技术的具体原理和操作细节,请查看我之前的帖子附件详细介绍,TALEN,CRISPER/Cas9技术做基因敲除技术资料-蚂蚁淘论坛。不清楚的请联系我咨询。此贴主要谈一谈在用这些技术进行癌细胞株阳性细胞克隆筛选的过程中,如何进行阳性克隆筛选,为初次接触这些新技术的研究者提供一些参考意见。
一般CRISPER-Cas9质粒转染后,采用有限稀释法接种到96孔板中长克隆,待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时,显微镜下仔细观察每一个孔的细胞,若发现非单克隆的细胞需要将其标注出来剔除筛选之外。传两代后,取出单个克隆的一部分细胞提取基因组DNA。
分析敲除位点的上下游序列,设计合适的引物,并从提取的基因组中扩出目的片段,然后选择部分阳性克隆进行PCR产物或做T载克隆送测序进行最终确认。
目前推崇的各种识别错配碱基的酶切鉴定方法及Surveyorassay试剂盒由于假阳性过高及过于昂贵,一般实验室我们不建议使用。少数试剂酶公司对于酶的推荐有利益因素驱动,希望各位战友注意甄别,土豪请忽略。(*^__^*)
运用CRISPER-Cas9技术进行癌细胞系的基因敲除,我们的经验是若设计的CRISPER-Cas9载体表达水平够高,敲除效率够高,此步骤多数时候可以直接省略。
详细的Protocol这里给出sigma最早ZFN的protocol,请查阅附件。这份protocol很经典,各位战友可以参考认真阅读一下。其他注意点如下,供参考。欢迎战友们补充。
建议一三事:(土豪别忽略)
1.土豪购买Surveyorassay的kit链接:
http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/surveyor-mutation-detection-kits
2.转染的时候就按照转染试剂推荐的DNA用量转染就可以。目前有Cas9和gRNA分别在两个不同的载体上的,也有在同一个载体上的,两个载体上的那套体系,建议转染时质粒DNA用量摩尔比例1:1。
3.设计上下游引物时,PCR产物的大小最好是四五百bp长比较合适,gRNA的targeting位点并不需要正好在PCR产物的中间。
4.做surveyorassay时用的PCRmix我们就是用的Sigma的JumpStartReadyMix,这个是热启动的Taq酶,mix里面没有DNA染料,可以直接用于surveyorassay。
5.分完96孔板之后大概一个星期能长出大小比较合适的单克隆,因为分细胞的时候不能保证完全均匀,有的孔里可能会长出2个或更多细胞克隆,所以需要在显微镜下把有多个克隆的孔剔除掉。我们习惯将96孔板里的单克隆消化下来再转到一个新的96孔板里,长满之后1/4-1/5再传代,剩下的细胞裂解之后提基因组DNA做surveyorassay。挑克隆鉴定的工作量比较大。
6.5中的两次传代目的是为了去除掉细胞培养基及细胞内的参与相关CRISPER-Cas9载体,以免形成二次切割,所获得的克隆不纯。建议最好要做这样一部操作。
7.更多详细的实验细节操作,欢迎联系我咨询或仔细阅读附件中的文件。
此贴若对您实验有帮助,记得常回来踩踩,道声感谢,给个力赞、怒赞啥的,鄙人不图其他,图个能帮助到更多的蚂蚁淘的战友们。也欢迎跟帖提问。我不定期回答大家的疑问。欢迎分享、转发、收藏给您的好友、同事、同学及***等。好东西请别自己独自藏着掖着。
预祝您实验顺利!
这个部分的PS也很重要,希望能够引起,特别是土豪们的注意。那就是关于癌细胞株用来从事科学研究之我见,供参考。欢迎战友们补充。土豪我们做朋友吧。嘻嘻!
PS一三事:(土豪请重视)
1.在癌细胞系上做基因敲除,科学家有此想法由来已久。HGP后,科学家能够读取基因信息,RNAi现象的发现被很快开发并运用到基因的敲低工作中来,虽然不能达到彻底敲除的目的,但至少在那个时代,在各方面数据及对照做足的情况下,给科学进步确实带来了很大帮助。
2.做过癌细胞株染色体相关的工作的科学家一定看过或者一定知道癌基因组的Variety是非常大的,很多时候对门实验室养的Hela细胞或者293T细胞和自己养的情况都不一定一样。染色体的各种缺失、多拷贝、异位、反转等等情况时有发现及发生,也不断在癌化当中。
3.针对2中的考虑,如果我们所研究的基因恰恰与癌细胞株的种种变异相关上,在此癌细胞株上做基因敲除就会有各种风险,土豪们需要额外注意选择一个合适的细胞系可能很关键。
4.所感兴趣基因的功能对于癌细胞本身的生长等是否会造成影响,这点的风险其实对于做基因敲除来讲也是存在的,虽然一般不会有大的影响。
5.根据我们的经验,至少CRISPER-Cas9技术基因敲除细胞系获得杂合子敲除(包含三整倍数aa的缺失或插入)阳性细胞克隆的获得概率约为10%;纯合子获得概率约为30%。不同基因情况不同,数据仅供参考,有时或高或低。
6.如果一次很难获得基因敲除纯合子的癌细胞克隆,癌细胞无法实现小鼠繁育类似的杂合子间交配获得纯合子,只能再次转染筛选。
7.不管是癌细胞培养还是RNAi技术(主要指shRNA),都是在一定的特殊历史时期或者科学家经费有限情况下的特殊时期的“无奈”选择。那个年代获得基因修饰动物及饲养动物成本要肯定远远比培养细胞高多了。
8.RNAi技术所在的一个特殊历史阶段,科学家无法很快及较低成本做到细胞系或小鼠个体水皮上的彻底敲除,只能退而求其次,实现在细胞或小鼠上敲低,再辅以其他数据与严格对着呼应。
9.如果土豪您有能力,请告诉我们您的心声,截止2014年获得CRISPER-Cas9基因敲除、基因敲入、基因条件性敲除、多基因、基因大片段(如两个,三个、甚至更多)敲除的小鼠获得的周期及成本越来越低。
10.动物水平实验研究的意义要远远超过细胞株实验的意义,这点自不必说。但细胞株实验的较高通量来筛选候选基因也有其固有的优势。
11.从整个细胞株建系周期及成本上看,和基因敲除动物相比,彼此彼此,没有绝对的优势。
CRISPER-Cas9技术筛选基因敲除细胞系阳性克隆Protocol-上海南方模式生物研究中心.pdf(310.12k)
CompoZrCustomZincFingerNuclease(ZFN)TechnicalBulletin-GenomeEditingProtocol.pdf(817.12k)
近几年来,基因重组的技术层出不穷,包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。
关于这些技术的具体原理和操作细节,这里不做展开介绍,主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中,如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐,做好这个关键的步骤。
一.混合克隆pool验证
质粒转染后48-72小时后取转染后细胞的pool1000个细胞以上离心,去上清,PBS洗一遍,细胞沉淀溶于适量的PBS中,煮5min后模板就制备好了,剩余的pool细胞做有限稀释,一般5块板足够。
分析敲除位点的上下游序列,设计合适的引物PCR扩增目的基因片段,与野生型目的基因杂交后CruiserTM酶切15-20分钟,酶切产物1.5%-2%凝胶电泳。
上图为混合克隆pool酶切检测,由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞,则进行下一步并计算突变率。这一步尤为重要,很多杂志投稿时需要这张图,或者有计算突变率的要求。
二.阳性克隆筛选
上一步采用有限稀释法接种到96孔板中的克隆,待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时,取出其中的一半细胞提取基因组。分析敲除位点的上下游序列,设计合适的引物,并从提取的基因组中扩出目的片段,然后选择CruiserTM或者T7EI进行酶切分析,最后将酶切分析得到的阳性克隆再进行测序进行最终确认。
为了可以很快的筛选到阳性克隆可以通过如下几个方式去进行优化:
1、尽可能提高单细胞的存活率
a)对于单个细胞很难存活的细胞,如果是贴壁细胞,可以试着加一些细胞因子促进细胞的分裂;而对于悬浮细胞,则推荐采用CellPlaza(共培养的原理),都可以极大的提高细胞的存活率;
b)对于很容易老化的细胞,推荐对细胞进行永生化改造,永生化的方法有很多,这里不做具体推荐。
2、采用能够快速抽提微量样品基因组DNA的试剂盒
这样的试剂盒,市面上也比较多,但是需要注意选择针对样品量比较少的试剂盒,建议选择Qiagen或者Genloci的微量样品的抽提试剂盒。QIAGEN是老品牌,Genloci这家公司是主要做基因重组的,所以,他们开发的一些产品针对性比较强,而且价格便宜,建议优先使用。
3、设计合理的引物和选用高保真的Taq酶
引物设计推荐选择靠近靶位点上游100bp和下游200bp处,或者上游200bp和下游100bp处,这样的好处是后面进行酶切分析的时候,对于阳性的克隆,可以很容易观察到2条分开的条带。
Taq酶,建议是用NEB的Fusion或者Q5,毕竟敲除本身很大可能也就是2-3个碱基的缺失,所以,高保证是必要的,防止产生假阳性的结果。
4、选择高特异性的错配酶
目前用的比较多的是CELI和T7EI两种酶,CELI是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶,活性高,不会产生假阳性。目前市面上只有CruiserTM和Surveyor和两个品牌。其中Surveyor是进口代理产品,价格较贵,货期较长;CruiserTM价格合适,同时货期短,国内可以2-3天内到货,做到真正质优价廉。
T7EI是NEB的产品,最早并不是为了做基因敲除筛选用的。其最主要的特点是除了识别错配外,还可以识别十字型结构DNA、Holliday结构或交叉DNA、异源双链DNA,正是因为这个特点,很容易导致假阳性的现象。
测序公司往往是比较容易忽略的一个环节,很多人送测序后,拿到的测序结果经常发现没信号,就认为是自己的样品有问题,而不会去怀疑测序公司。实际上是错误的思维方式,测序是苦力活,人员流动比较大,所以经常会发现某一段时间的测序结果总是不好,实际上跟样品无关而跟测序公司的人员流动有很大关系。所以,一定要找一些资质比较好的测序公司,同时,发现问题的时,可以考虑换一家公司再测一遍。
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