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转染技术的要点及转染试剂正确选择
2016-08-31
问题描述:

转染技术的要点及转染试剂正确选择

转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术,它是研究基因表达调控,突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起,其应用越来越广泛。以下就向大家介绍一些转染的技术要点及市面上主要的转染试剂类型的选择。
常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-96小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
转染效率收多种因素影响,主要因素有下面几个:

1.细胞培养

健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基血清添加物。低的细胞代数(<50)能确保基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度,一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在转染前24小时分细胞,这将提供正常细胞代谢,增加对外源DNA摄入的可能。一定要避免细菌,支原体或真菌的污染。

2.血清

大多数培养基在使用前需要加血清。胎牛血清(FCS)经常用到,便宜一点的有马或牛血清。通常的,血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物,对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测(转右)试出对细胞生长良好的血清批号,转染时用同一批号的血清,并同时做负对照(不加转染试剂及外源DNA)以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低,因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤,甚至死亡导致转染效率极低。

3.载体构建

转染载体的构建(病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等)也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高,但不同病毒载体有其特定的宿主,有的还要求特定的细胞周期,如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞,此外还需考虑一些安全问题(如基因污染)。除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响,如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用,转染也很难进行,因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。

4.DNA质量

DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术(如脂质体等)基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国Qiagen公司提供的超纯质粒抽提试剂盒,能达到两倍2xCsCl梯度离心以上的纯度效果,使您不必为DNA质量操心。此外,对一些内毒素敏感的细胞(如原代细胞,悬浮细胞和造血细胞),QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒,在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子,保证理想的转染效果。

5.转染技术

转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下:

转染方法原理应用特点

DEAE-右旋糖苷法

带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清
磷酸钙法
磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染,瞬时性转染不适用于原代细胞,操作简便但重复性差,有些细胞不适用。
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入稳定转染,瞬时性转染,所有细胞适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大,需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件

阳离子性的脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染

瞬时性转染,所有细胞适用性广,转染效率高,重复性好但转染时需除血清

转染效果随细胞类型变化大

病毒介导法
逆转录病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染,特定宿主细胞可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大
细胞需处分裂期,需考虑安全因素,腺病毒瞬时转染,特定宿主细胞可用于难转染的细胞,需考虑安全因素。

Biolistic颗粒传递法
将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达瞬时性转染可用于:人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞

显微注射法
用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染,瞬时性转染转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。

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dxy2013bj
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脂质体转染原理  脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层,又称为人工生物膜。最初,人们只是运用脂质体模拟生物膜,研究膜的构造及功能,从而发现了膜的融合及内吞作用,因而可用作外源物质进入细胞的载体。  阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内,形成DNA一脂复合体,也能被表面带负电荷的细胞膜吸附,再通过膜的融合或细胞的内吞作用,偶尔也通过直接渗透作用,将  DNA传递进入细胞,形成包涵体或进入溶酶体 其中一小部分DNA能从包涵体内释放,并进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。 
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dxy2013bj
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 已有众多的文献报道,脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC(蛋白激酶C)通路调节(Biochemistry.1992Sep22;31(37):9025-30);如抑制ATP酶的活性(BiochimBiophysActa.2008Apr;1777(4):362-8);如与线粒体膜发生作用(JBiolChem.1989Jan25;264(3):1508-15);转染siRNA造成脱靶效应等等。细胞毒性的大小往往意味着对细胞生理活动影响的大小,脂质体这些作用是造成细胞毒性的根本原因。这会对相关研究数据产生严重的干扰,甚至影响研究的结论。这已引起了许多研究者的注意。 虽然人们早已发现脂质体对细胞的毒性,对研究的影响,但由于一直没有更好的方法尤其是更高效的转染方法代替脂质体,所以脂质体转染试剂一度应用非常广泛。同时,人们也一直在寻找更有效、毒性小同时对研究影响也小的转染试剂。由于脂质类转染试剂对细胞的毒性是由其脂质特性决定的,目前众多的研究者和生物公司将新一代转染试剂的开发聚焦在非脂质体的聚合物上,并已有一些优秀的试剂产品上市。
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dxy2013bj
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EntransterTM-R4000是英格恩生物(EngreenBiosystem)最新研发合成的针对siRNA、microRNA、mimic、inhibitor、mRNA和shRNA等RNA的转染试剂。EntransterTM-R4000不仅可以转染小RNA,而且针对mRNA等长链RNA优化。由于纳米技术的应用,EntransterTM-R4000能做到高达90%的转染效率和60-90%的沉默效率,对难转染细胞和原代细胞也非常适用。
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dxy2013bj
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适用于:小RNA转染。包括siRNA转染,miRNA,mimic,inhibitor等。长链的mRNA和shRNA转染,针对mRNA和长链的shRNA等RNA转染优化。可转染动物细胞、昆虫细胞等,也可以转染原代细胞、悬浮细胞和原代细胞等传统难转染细胞。特点:最新转染试剂,纳米聚合物,转染效果优于脂质体转染试剂高效转染,沉默效率高,可以达到90%以上的沉默效率低细胞毒性,有血清转染,无须反复更换培养基原代细胞、悬浮细胞和敏感细胞都能转
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dxy2013bj
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1.TumourBiol.2016Mar.MiR-30aregulatestheproliferation,migration,andinvasionofhumanosteosarcomabytargetingRunx2.(MiR-30a通过靶向作用于小家畜相关的转录因子2(Runx2)进而调节人骨肉瘤细胞的增值、迁移及侵袭)2.PLoSOne.2015Mar31.MicroRNA-22impairsanti-tumorABIlityofdendriticcellsbytargetingp38.(MicroRNA-22通过靶向作用于p38蛋白削弱树突状细胞的抗肿瘤能力)3.MolBiosyst.2015NovTheinvolvementofaquaporin1inthehepatopulmonarysyndromeratserum-inducedmigrationofpulmonaryarterialsmoothmusclecellsviathep38-MAPKpathway.(肝肺综合征相关的研究)4.JImmunol.2015Aug1.MicroRNA-9RegulatestheDifferentiationandFunctionofMyeloid-DerivedSuppressorCellsviaTargetingRunx1(MicroRNA-9通过靶向作用于Runx1调节髓源性抑制细胞的分化和功能)5.ImmunolRes.2015Jun.DecreasedexpressionofmicroRNA-125a-3pupregulatesinterleukin-23receptorinpatientswithHashimoto’sthyroiditis.(microRNA-125a-3p的低表达可以上调淋巴瘤性(样)甲状腺肿病人白细胞介素-23受体的水平).6.IntJMolMed.2015Dec.miR-21synergizeswithBMP9inosteogenicdifferentiationbyactivatingtheBMP9/Smadsignalingpathwayinmurinemultilineagecells.(miR-21激活小鼠干细胞中BMP9/Smad信号通路与BMP9协同作用于成骨细胞分化的研究)7.JBiolChem.2010Apr2;285(14):10890-901.XenopusskipmodulatesWnt/beta-cateninsignalingandfunctionsinneuralcrestinduction.8.Apoptosis.2010Apr;15(4):488-98.APKC-betainhibitorprotectsagainstcardiacmicrovascularischemiareperfusioninjuryindiabeticrats.9.MicrovascRes.2010Jan14.APKC-betainhibitortreatmentreversescardiacmicrovascularbarrierdysfunctionindiabeticrats.10.JImmunol.2011Apr15;186(8):4716-24.BothmiR-17-5pandmiR-20aAlleviateSuppressivePotentialofMyeloid-DerivedSuppressorCellsbyModulatingSTAT3Expression.11.JSexMed.2011Oct;8(10):2773-80.Up-regulationofVEGFbysmallactivatorRNAinhumancorpuscavernosumsmoothmusclecells.12.CellBiochemFunct.2011Oct26.Theeffectsofmyocyteenhancerfactor2Ageneontheproliferation,migrationandphenotypeofvascularsmoothmusclecells.13.VirusRes.2012Jan;163(1):183-9.SmallinterferingRNAagainstthe2CgenomicregionofcoxsackievirusB3exertspotentialantiviraleffectsinpermissiveHeLacells.14.GenesImmun.2012Jan26.GlobalmappingofH3K4me3andH3K27me3revealschromatinstate-basedregulationofhumanmonocyte-deriveddendriticcellsindifferentenvironments.15.JournalofRADIationResearch.2012June6.MicroRNA-148benhancestheradiosensitivityofnon-Hodgkin’sLymphomacellsbypromotingradiation-inducedapoptosis.16.JCellSci.2012May28.RegulationofapoptosisbyBat3-enhancedYWK-IIprotein/APLP2stability.17.Cytokine.2012Jul29.BLySexpressionandJNKactivationmayformafeedbacklooptopromotesurvivalandproliferationofmultiplemyelomacells.18.GenesImmun.2012Oct4.TGF-β-associatedmiR-27ainhibitsdendriticcell-mediateddifferentiationofTh1andTh17cellsbyTAB3,p38MAPK,MAP2K4andMAP2K7.19.RespirPhysiolNeurobiol.2012Oct8.EffectofannexinA2onhepatopulmonarysyndromeratserum-inducedproliferationofpulmonaryarterialsmoothmusclecells.20.BiochemJ.2012Nov1;447(3):407-16.Promoter-associatedsmalldouble-strandedRNAinteractswithheterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1toinducetranscriptionalactivation.21.CellSignal.2013Jan15.SASH1regulatesmelanocytetransepithelialmigrationthroughanovelGαs-SASH1-IQGAP1-E-Cadherindependentpathway.22.JImmunol.2013Jan25.MultipleTumor-AssociatedMicroRNAsModulatetheSurvivalandLongevityofDendriticCellsbyTargetingYWHAZandBcl2SignalingPathways.23.Apoptosis.2013May25.ThehistonedeacetylaseinhibitorvorinostatpreventsTNFα-inducednecroptosisbyregulatingmultiplesignalingpathways.24.MolecularBioSystems.2013Nov29.PaxillinsuppressestheproliferationofHPSratserumtreatedPASMCsbyup-regulatingtheexpressionofcytoskeletalproteins
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妙语解烦6
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细胞实验转染试剂如何选择?转染不成功?转染效率不高?用过汉恒的转染试剂,效果不错,推荐给大家!可以点击下面丁香通链接,免费试用下汉恒的转染试剂!—【汉恒生物转染试剂免费申领-丁香通】
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qingwudarao
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英格恩生物的转染试剂不错,效率挺高的,毒性小,价格便宜,值得一用。
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