ProducefullyRNaseA-resistantRNAthatisperfectlysuitedforRNAaptamersynthesis,aswellasantisenseRNAandRNAinterference(RNAi)experiments.
- ProtecttranscribedRNAfromRNAsedegradation
- ProducehighRNAyields
- SelectandoptimizeRNAaptamersusingSELEXscreening
- SeeFAQ
TheDuraScribe®T7TranscriptionKit*isaninvitrotranscriptionkitthatproducesRNA-calledDuraScript®RNA-thatiscompletelyresistanttoRNaseAdigestion.
TheDuraScribeT7TranscriptionKitincludesDuraScribeT7RNAPolymerase,anenhancedformulationoftheY639Fmutant1ofT7RNAPolymerasethatefficientlyincorporates2´-Fluorine-CTP(2´-F-dCTP),2´-Fluorine-UTP(2´-F-dUTP),ATPandGTPintoRNase-resistantRNAtranscriptscalledDuraScriptRNA(Figure1).TheDuraScribeT7RNAPolymeraseusesthesameT7promotersasthewild-typeT7RNAPolymerase.
Applications
DuraScriptRNAhasdemonstratedadvantagesforRNAaptamersynthesis,andribozyme,RNAinterference(RNAi)andantisenseRNAstudies.
Features
- DuraScriptRNAisresistanttoRnaseAandDnase
- HighYieldsofDuraScriptRNA
- T7invitrotranscriptionreations.DuraScribeT7RNAPolymeraseusesthesameT7promotersasthewildtypeT7RNAPolymerase.
- IdealforRNAaptamerstudies.NumerouscitationsusingtheDuraScribeKitwithRNAaptamers
- SELEX-compatIBLe.DuraScriptRNAcanbeusedinSELEXselectionprocesses.
- MakelongorshortDuraScriptRNA.Double-strandoligos,linearizedplasmids,andPCRproductswithaT7polymerasepromotercanbetranscribed.
Table1.YieldofDuraScript®RNAfromaDuraScribe®Kitreaction.Onemicrogramofa3-KbDNAtemplatewaslinearizedatdifferentsitesandthentranscribedinaDuraScribeT7TranscriptionKitreactionfor4hours.TheyieldofDuraScriptRNAproducedfromeachtemplateisshowninmicrograms(µg)andinpicomoles(pmol).
SizeofDuraScriptRNAproduced | DuraScriptRNAYield(µg) | DuraScriptRNAYield(pmol) |
2600nts | 100µg | 116pmol |
1400nts | 58µg | 124pmol |
330nts | 18µg | 164pmol |
88nts | 9µg | 307pmol |
Figure1(clicktoenlarge).TheDuraScribe®T7RNAPolymeraseefficientlyincorporates2´-F-dCTPand2´-F-dUTPintofull-lengthDuraScript®RNA.Thepresenceofthefluorineatthe2´-positionofthe2´-F-dCand2´-F-dUnucleotidespreventsdigestionbyRnaseA. | Figure2.YieldofRNAfromaDuraScribe®T7Transcriptionreaction.Astandardreaction(4-6hours)produced40-60µgofa1.4-kbDuraScript®RNA. |
Figure3.DuraScript®RNAisresistanttoRnaseAdigestion.A1.4-kbstandardRNAtranscriptanda1.4-kbDuraScriptRNAtranscriptwereeachincubatedwith1UofhighlypurifiedRnaseAfor30minutes.ThestandardRNAtranscriptwascompletelydegradedwhiletheDuraScriptRNAtranscriptremainedintact.LaneM,sizeladder;lane1,1.4-kbstandardRNAtranscript;lane2,standardRNAafterRnaseAtreatment;lane3,1.4-kbDuraScriptRNA;lane4,DuraScriptRNAafterRnaseAtreatment. | Figure4.DuraScript®RNAiscompletelyresistantto"finger"nucleases.A1.4-kbstandardRNAtranscriptanda1.4-kbDuraScriptRNAtranscriptwereproducedusingsterilewaterorwaterthathadbeencontaminatedbyexposuretothehandsofatestsubject.ThestandardRNAshowsextensivedegradationfrom"finger"nucleasesinthecontaminatedwaterwhiletheDuraScriptRNAremainsfullyintact.M,Sizeladder;Lane1,StandardRNAtranscript;Lane2,StandardRNAafter"finger"nucleaseexposure;Lane3,DuraScriptRNA;Lane4,DuraScriptRNAafter"finger"nucleaseexposure. |
*Coveredbyissuedand/orpendingpatents.
References
- Sousa,R.andPADIlla,R.(1995)EMBOJ.14:184609-4621.
ORDERINFORMATION
Contents:DuraScribeT7EnzymeMix,RNase-FreeDuraScribeT710XReactionBuffer,ATP,GTP,2-F-dCTP,2-F-dUTP,DNaseI,DTT,ControlTemplateDNA(linearized),SterileDeionizedWater.ebiomall.com
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质粒转染一般是说DNA转染,用常用的sinofection等转染试剂就可以;
小干扰RNA(Small interfering RNA;siRNA)有时称为短干扰RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA),是一个长20到25个核苷酸的双股RNA,这种RNA的转染需要用专门的RNA转染试剂。
DXY721认为:
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大,主要差别在于转染后的筛选,当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单,问题是能不能转的进去的,转染率能有多少,转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染,说明书上都有具体的操作过程,将脂质体和目的基因按比例混合,然后加到细胞悬液里就OK了,说的简单,实际上还是有一些细节要注意的,比如脂质体和目的基因混合的比例,转染的细胞数,细胞的代数,细胞的状态,有的还要求在转染的前一天传代一次,不过不要怕,这些在脂质体说明书上都有明确的说明,按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为:
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理,先形成脂质体-DNA复合物,散布在细胞周围,然后通过细胞的内吞作用,将目的基因导入细胞内,而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍,所以,脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法,目前为止,悬浮细胞转染的最好方法还是电转,我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的,使用条件是电压250V,电容975uF,效果不错,不妨一用。
近期,上海公卫临床研究中心的一位研究生应用两种转染试剂Turbofecttransfectionreagent(Thermo)和EntransterTM-R4000(Engreen)进行了一次RNA转染比较。比较情况如下:
实验方法
转染试剂:Turbofecttransfectionreagent(Thermo)和EntransterTM-R4000(EngreenBiosystemCo,Ltd)
待处理细胞:humanCD8+T细胞
1.针对Turbofect转染的方法
每孔培养体积均为100μL,细胞数目在105左右。
取0.5μLagomir,加入9.5μL无血清RPMI1640,充分混匀;
取0.2μLTurbofecttransfectionreagent和agomir稀释液充分混合。
转染复合物制备完成;混匀后室温下孵育15-20分钟,直接取10μL加入已铺好细胞的孔中,继续培养24h收取细胞,用PBS洗涤3次以上,以备RNA抽提。
转染Mix的配制:100nMago/N.C.:(0.5μLagomir+0.2μLTurbofect+9.3μL无血清的RPMI1640)×2.5=1.25+0.5+23.25
2.EntransterTM-R4000转染
每孔培养体积均为100μL,细胞数目在105左右。
取0.5μLagomir,加入9.5μL无血清RPMI1640,充分混匀,制成10μLagomir稀释液;
取0.25μLEntransterTM-R4000,然后加入9.75μL无血清稀释液体,充分混匀,制成10μLEntransterTM-R4000稀释液;
将EntransterTM-R4000稀释液和agomir稀释液充分混合(可用振荡器或加样器吹吸10次以上),室温静置15分钟。
转染复合物制备完成;
将20μL转染复合物加入孔中的细胞悬液中,前后移动培养皿,混合均匀;
转染后6h观察细胞状态,并更换培养基,继续培养24h后收取细胞,用PBS洗涤3次以上,以备RNA抽提。
转染Mix的配制:100nMago/N.C.:(0.5μLagomir+9.5μL无血清的RPMI1640)×2.5=1.25+23.75;Etranster稀释液:(0.25μLEtranster+9.75μL无血清的RPMI1640)×5=1.25+48.75(室温静置5分钟),取20μL至ago和N.C.管中,室温静置15分钟。
实验结果
结论:从目的miRNA表达水平的检测结果来看,转染24h后,英格恩生物公司(EngreenBiosystem)的EntransterTM-R4000(ago/NC:422912倍)转染试剂的效果优于Turbofect转染试剂(ago/NC:285870倍)。
讨论:从实验结果来看,英格恩生物公司(EngreenBiosystem)的EntranstenTM-R4000(ago/NC:422912倍)转染试剂的效果优于Turbofect转染试剂(ago/NC:285870倍)。EntransterTM-R4000是英格恩生物(EngreenBiosystem)最新研发合成的针对siRNA、microRNA、mimic、inhibitor、mRNA和shRNA等RNA的转染试剂。EntransterTM-R4000不仅可以转染小RNA,而且针对mRNA等长链RNA优化。该试剂可将RNA导入多种细胞系,包括原代细胞和悬浮细胞。无论有无血清、抗生素存在均可获得很高的转染效率。
而且直接使用自制的PEI非常便宜,在293上远比商品化的脂质体要好。
另外,如果你们实验室确实钱多,不怕花钱,建议你取用Promega的FugenHD,那个转染效率比脂质体更好,而且毒性小,至于价格。。。。。。。。。。。也更高。。。。。。。。。
另外,你说漂浮的细胞有表到GFP,那个不一定是真的GFP,很多时候
—DNA转染试剂Polyjet-适用于普遍的哺乳动物细胞
LipoD293-适用于悬浮细胞的转染(包括昆虫细胞SF9)-对于普遍的哺乳动物细胞具有更优异的转染效率
—DNAandsiRNA转染试剂
Lipojet-适用于大多数哺乳动物细胞的转染-低毒性(无需换液)-用量少-DNA/RNA共转染(co-transfection)-效果优于Lipofectamine2000
—siRNA转染试剂
GenMute-适用于大多数哺乳动物细胞转染-低毒性(无需换液)-用量少-DNA/siRNA共转染(co-transfection)PepMute-适用于普遍的哺乳动物细胞的转染
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