RandominsertionofR6KoriginforrescueofflankingDNAorplasmids
- InsertR6KoriginrandomlyintoanyDNAsequenceinvitro
- Skipprimerwalking-simplifySangersequencingoflargeDNAinserts
- RescueclonesinE.colihostexpressingthepirgeneproduct
- MinimizeinsertionbiaswiththehyperactiveTn5system,knownforhighestlevelofrandomness
Applications
- "Rescue"ofplasmidsoranyothercircularizedDNA(e.g.,mitochondrialDNA)thatwouldnototherwisereplicateinE.colibecausetheylackarecognizableoriginofreplicationand/oraselectableMarker.
- PreparationofDNAsequencingtemplatesfromtransposoninsertioncloneswithoutprimerwalkingoradditionalsubcloning.
- Creationofalibraryofrandomgeneknockoutsinvitrotofacilitategeneticanalysisofplasmid-encodedgenes.
TheEZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>InsertionKit*facilitatesthesequencingandgeneticanalysisofplasmidsoranyothercircularizedDNAthatwouldnototherwisereplicateinE.coli.1,2ThekitisbasedupontheEZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>TransposonwhichcarriestheE.coliR6Kγconditionaloriginofreplication(R6Kγori)andakanamycinresistancemarker.Asimple,one-step,2-hourinvitroreactionrandomlyinsertsthetransposonintothetargetDNA.ThenanaliquotofthereactionisusedtotransformanE.colihostexpressingthepirgeneproduct,whichisrequiredforreplicationfromtheR6Kγori.Insertionclonesareselectedonkanamycinplatesandcanbesequencedbidirectionallyusingtheprovidedprimersthatarehomologoustotheendsofthetransposon.ClonescanbemaintainedinEpicentre'sTransforMax™EC100D™pir+orTransforMax™EC100D™pir-116strains.3
Figure1.AplasmidcontainingtheEZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>TransposoncanbemaintainedinTransforMax™EC100D™pir+cellsat~15copiespercell(Lanes1-4)orTransforMax™EC100D™pir-116cellsat~250copiespercell(Lanes5-8).ColoniesfromrandomlychosencloneswereprocessedusingtheColonyFast-Screen™Kit.A5-microliteraliquotoflysatewasloadedperlane.M,supercoiledDNAladder. |
References
- Jendrisak,J.etal.(2002)EpicentreForum9(1),14.
- Yoon,Y.andKoob,M.(2003)EpicentreForum10(2),10.
- Metcalf,W.W.etal.(1994)Gene138,1.
*Coveredbyissuedand/orpendingpatents,exclusivelylicensedorassignedtoEpicentre®(anIllumina®Company).
ORDERINFORMATION
EZ-Tn5™Transposase,EZ-Tn5™<R6Kyori/KAN-2>Transposon,EZ-Tn5™10XReactionBuffer,EZ-Tn5™10XStopSolution,ForwardandReversePrimers,ControlTargetDNA,SterileWater.ebiomall.com
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但是在选择的时候,也需要注意其他的一些问题。
1、采用何种原料和抗体,是否高效、灵敏、特异
2、规范包被操作,吸附是否均匀
3、重复性、可靠性
6、是否提供技术服务
7、适用于血浆、血清、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等多种类型的样本
8、可检测动物类型是否丰富
9、可检测指标是否齐全
elisa试剂盒就查下博欧特生物
使用方法:
1、 血清:操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。
2、 血浆:EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、 细胞上清液:1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟,取上清液。
5、 保存:如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
DXY721认为:
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大,主要差别在于转染后的筛选,当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单,问题是能不能转的进去的,转染率能有多少,转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染,说明书上都有具体的操作过程,将脂质体和目的基因按比例混合,然后加到细胞悬液里就OK了,说的简单,实际上还是有一些细节要注意的,比如脂质体和目的基因混合的比例,转染的细胞数,细胞的代数,细胞的状态,有的还要求在转染的前一天传代一次,不过不要怕,这些在脂质体说明书上都有明确的说明,按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为:
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理,先形成脂质体-DNA复合物,散布在细胞周围,然后通过细胞的内吞作用,将目的基因导入细胞内,而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍,所以,脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法,目前为止,悬浮细胞转染的最好方法还是电转,我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的,使用条件是电压250V,电容975uF,效果不错,不妨一用。
内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁(cellwall)上的特有成分,主要是脂多糖中的类脂A,在细菌被裂解时被释放出来,由于其化学结构和特性,在质粒的纯化过程中很容易混入质粒DNA一同提取出来。内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率,此外会激活造血细胞(如B细胞、巨噬细胞等)的非特异免疫反应,造成实验的假阳性,所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。
对重复性要求不高的试验,一般没有问题的,只不过可能需要增加一些转染试剂用量了。
为了避免这个问题,推荐收到货之后,进行适当分装,用多少,拿出来多少最好。
有战友对比过罗氏X-tremeGENEDNATransfectionReagent和lipofectamine3000的优劣吗?求解答
—DNA转染试剂Polyjet-适用于普遍的哺乳动物细胞
LipoD293-适用于悬浮细胞的转染(包括昆虫细胞SF9)-对于普遍的哺乳动物细胞具有更优异的转染效率
—DNAandsiRNA转染试剂
Lipojet-适用于大多数哺乳动物细胞的转染-低毒性(无需换液)-用量少-DNA/RNA共转染(co-transfection)-效果优于Lipofectamine2000
—siRNA转染试剂
GenMute-适用于大多数哺乳动物细胞转染-低毒性(无需换液)-用量少-DNA/siRNA共转染(co-transfection)PepMute-适用于普遍的哺乳动物细胞的转染
想用RNAiMAX或者lipo2000转染siRNA,但是看了下转染试剂的说明书和锐博的siRNA说明书,觉得分别对siRNA的用量描述差别挺大的呀,不知道到底该参考哪个呢。
以24孔板为例在siRNA说明书中写到,siRNA终浓度是50nM的话,加入浓度为20μM的siRNA1.25ul,每孔体积是500ul,那这样的话,每孔最终siRNA的量是25pmol。
但是在RNAiMAX或者是lipo2000说明书中,一个写的每孔siRNA用量是5pmol,一个是500ng,这与siRNA厂家所提供的量相差也太多了吧。
到底该看哪一个呢。
ps.一旦siRNA的量和体积确定下来之后,转染试剂的量和siRNA1:1的加就可以了吗?
请各位大神解答。
1.siRNA说明书中的用量,红线圈出
2.RNAIMAX说明书中siRNA的用量。
3.lipo2000说明书中siRNA用量
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