RescuecloningofEZ-Tn5™transposedelements
- RescuetranspositionmutantscreatedusingtheEZ-Tn5™R6KɣoriKan-2>InsertionKit
orTnpTransposome™Kit
- PropagateplasmidstaggedwiththeEZ-Tn5™R6KɣoriKan-2>InsertionKit
TheTransforMax™EC100D™pir+ElectrocompetentE.coliandTransforMax™EC100D™pir-116ElectrocompetentE.colieachconstitutivelyexpresstheπprotein(thepirgeneproduct)forreplicationofplasmidscontainingtheR6Kγoriginofreplication(R6Kγori).ThecellsarederivedfromEpicentre'sTransforMax™EC100™ElectrocompetentE.colibyP1phagetransductionwithastraincontainingthepir+orpir-116genelinkedtoadihydrofolatereductase(DHFR)Marker.
TheTransforMaxEC100Dpir+cellswillmaintainR6Kγoricontainingplasmidsatapproximately15copiespercell,1forcloningofpotentiallytoxicorunstableDNAsequences.TheTransforMaxEC100Dpir-116cellsareforhigh-copypropagationofupto250rescueplasmidcopiespercell.1
Benefits
- AcceptslargeclonesforunbiasedpropagationandstABIlityoflargerescueclones.
- lacZΔM15forblue/whitescreeningofrecombinants.
- Restrictionminus[mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]enablesefficientcloningofmethylatedDNA.
- Endonucleaseminus(endA1)toensurehighyieldsofDNA.
- Recombinationminus(recA1)forgreaterstabilityoflargeclonedinserts.
Genotypes
TransforMaxEC100Dpir+ElectrocompetentE.coli:
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsL(StrR)nupGpir+(DHFR)TransforMaxEC100Dpir-116ElectrocompetentE.coli:
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsL(StrR)nupGpir-116(DHFR)
TransformationEfficiency
Greaterthan5×109colonyformingunits(cfu)/µgwithpR6KancontrolDNA.
References
- Metcalf,W.W.etal.(1994)Gene138,1.
ORDERINFORMATION
Eachproductcontains5tubeseachcontaining100µLofelectrocompetentcells,whichisenoughcellsfor10electroporations.AcontrolvectorcontainingandR6Kγoriisalsoincludedwitheachproduct.ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
质粒转染一般是说DNA转染，用常用的sinofection等转染试剂就可以；
小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，这种RNA的转染需要用专门的RNA转染试剂。
DXY721认为：
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大，主要差别在于转染后的筛选，当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单，问题是能不能转的进去的，转染率能有多少，转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染，说明书上都有具体的操作过程，将脂质体和目的基因按比例混合，然后加到细胞悬液里就OK了，说的简单，实际上还是有一些细节要注意的，比如脂质体和目的基因混合的比例，转染的细胞数，细胞的代数，细胞的状态，有的还要求在转染的前一天传代一次，不过不要怕，这些在脂质体说明书上都有明确的说明，按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为：
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法，目前为止，悬浮细胞转染的最好方法还是电转，我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的，使用条件是电压250V，电容975uF，效果不错，不妨一用。
近期，上海公卫临床研究中心的一位研究生应用两种转染试剂Turbofecttransfectionreagent（Thermo）和EntransterTM-R4000（Engreen）进行了一次RNA转染比较。比较情况如下：
实验方法
转染试剂：Turbofecttransfectionreagent（Thermo）和EntransterTM-R4000（EngreenBiosystemCo,Ltd）
待处理细胞：humanCD8+T细胞
1.针对Turbofect转染的方法
每孔培养体积均为100μL，细胞数目在105左右。
取0.5μLagomir，加入9.5μL无血清RPMI1640，充分混匀；
取0.2μLTurbofecttransfectionreagent和agomir稀释液充分混合。
转染复合物制备完成；混匀后室温下孵育15-20分钟，直接取10μL加入已铺好细胞的孔中，继续培养24h收取细胞，用PBS洗涤3次以上，以备RNA抽提。
转染Mix的配制：100nMago/N.C.：（0.5μLagomir+0.2μLTurbofect+9.3μL无血清的RPMI1640）×2.5=1.25+0.5+23.25
2.EntransterTM-R4000转染
每孔培养体积均为100μL，细胞数目在105左右。
取0.5μLagomir，加入9.5μL无血清RPMI1640，充分混匀，制成10μLagomir稀释液；
取0.25μLEntransterTM-R4000，然后加入9.75μL无血清稀释液体，充分混匀，制成10μLEntransterTM-R4000稀释液；
将EntransterTM-R4000稀释液和agomir稀释液充分混合（可用振荡器或加样器吹吸10次以上），室温静置15分钟。
转染复合物制备完成；
将20μL转染复合物加入孔中的细胞悬液中，前后移动培养皿，混合均匀；
转染后6h观察细胞状态，并更换培养基，继续培养24h后收取细胞，用PBS洗涤3次以上，以备RNA抽提。
转染Mix的配制：100nMago/N.C.：（0.5μLagomir+9.5μL无血清的RPMI1640）×2.5=1.25+23.75；Etranster稀释液：（0.25μLEtranster+9.75μL无血清的RPMI1640）×5=1.25+48.75（室温静置5分钟），取20μL至ago和N.C.管中，室温静置15分钟。
实验结果
结论：从目的miRNA表达水平的检测结果来看，转染24h后，英格恩生物公司（EngreenBiosystem）的EntransterTM-R4000(ago/NC:422912倍)转染试剂的效果优于Turbofect转染试剂(ago/NC:285870倍)。
讨论：从实验结果来看，英格恩生物公司（EngreenBiosystem）的EntranstenTM-R4000(ago/NC:422912倍)转染试剂的效果优于Turbofect转染试剂(ago/NC:285870倍)。EntransterTM-R4000是英格恩生物（EngreenBiosystem）最新研发合成的针对siRNA、microRNA、mimic、inhibitor、mRNA和shRNA等RNA的转染试剂。EntransterTM-R4000不仅可以转染小RNA，而且针对mRNA等长链RNA优化。该试剂可将RNA导入多种细胞系，包括原代细胞和悬浮细胞。无论有无血清、抗生素存在均可获得很高的转染效率。
而且直接使用自制的PEI非常便宜，在293上远比商品化的脂质体要好。
另外，如果你们实验室确实钱多，不怕花钱，建议你取用Promega的FugenHD,那个转染效率比脂质体更好，而且毒性小，至于价格。。。。。。。。。。。也更高。。。。。。。。。
另外，你说漂浮的细胞有表到GFP，那个不一定是真的GFP，很多时候
—DNA转染试剂Polyjet-适用于普遍的哺乳动物细胞
LipoD293-适用于悬浮细胞的转染（包括昆虫细胞SF9）-对于普遍的哺乳动物细胞具有更优异的转染效率
—DNAandsiRNA转染试剂
Lipojet-适用于大多数哺乳动物细胞的转染-低毒性（无需换液）-用量少-DNA/RNA共转染（co-transfection）-效果优于Lipofectamine2000
—siRNA转染试剂
GenMute-适用于大多数哺乳动物细胞转染-低毒性（无需换液）-用量少-DNA/siRNA共转染（co-transfection）PepMute-适用于普遍的哺乳动物细胞的转染
暂无品牌问答
© 2005- 苏州蚂蚁淘生物科技有限公司 版权所有。
苏ICP备17049038号-11
苏公网安备 32059002001627号
声明：本网站部分产品受外界条件影响（包含但不限于进口国出口国政策限制等因素），无法提供销售服务，下单后，会由客服人员联系厂家确认后另行通知。部分危险品无法清关，请勿下单