一、提取抗原蛋白

将提取RNA途中留存的样品，加入150μl100%酒精充分混匀，静置5min(RT),2000×g,4℃离心5min,吸取上清至新管中,加入750μl异丙醇,混匀,静置10min(RT),12000×g,4℃离心10min,弃上清,加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀,用加样器打散沉淀,混旋20~30秒,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,重新加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精两次,重悬沉淀,离心后弃上清,加入100%无水乙醇1ml,混旋1min,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,真空干燥5min,50μl1%SDS溶解沉淀，用50℃热水助溶，直至全部溶解。10000×g,离心10min,去除沉渣。

二、蛋白定量

1.取PBS、各样品10ul，加DW990ul

2.取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5ml。

3.向各管加入2.5mlD试剂（A50ml＋B0.5ml＋C0.5mlA－2%[陈星云1][陈星云1]Na₂CO₃、0.1NNaOH，B－0.5%CuSO₄，C－1%酒石酸钠）混匀，静置10分钟。

4.迅速加入酚试剂0.25ml，混匀37℃水浴30分钟。

5.721分光光度计650nm，比色，S₀标准管调零。

6.最后稀释为4ug/ul，加载样缓冲液后，终浓度为2ug/ul，上样量为30～80ug/泳道。

三、电泳

1.makegel．

2.上样前样品处理：

样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30S。

3.通电电：积层胶电泳电压50V左右，分离胶电泳电压90～110V。

4.考马斯亮蓝染色：1小时，1号脱色1小时，2号脱色2小时。

四、电转印

1.将滤纸NcM切成与凝胶尺寸大小，置于DM中浸透5分钟，电转液平衡15分钟。

2.转移：用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将NcM、胶夹于中间，在NcM与大滤纸之间垫小滤纸。NcM朝正极，20V恒压转移12小时。取下NcM杂交，凝胶染色看效果。

五、杂交

1.取下NcM，做好标记，dH₂O冲洗，室温滤纸干或放入膜固定液15分钟。

2.NcM用PBS冲洗二遍，呈5～6%non－fatmilk的pH7.2的PBS中封闭，室温６－８小时或室温1－2小时，4℃，过夜。

3.将封闭的膜用ＰＢＳ冲洗一遍，洗15分钟×1，5分钟×2。

4.加入一抗1:1000－1200，室温，反应1小时

5.PBS洗15分钟×1，15分钟×4。

6.加入二抗1:5000，室温，反应1小时。

7.PBS洗15分钟×1，5分钟×4。

六、化学发光试剂检测

1.混合等体积Bottle1&2与NcM共孵育1分钟。

2.放射自显影：曝光3分钟至10分钟。

3.显影后清水漂洗，再定影。

七、所用试剂

1、匀浆缓冲液4×1L：

（1）用时稀释4倍。

（2）40mlPBS＋PMSF40ul＋1.10phenautehroline80ul＋Iodo80ul＋pepstalmA80ul

2.系列牛血清蛋白浓度稀释法：

取500ug/mlBSA按下法配制：

3.30%Acrylamide

29.2g单丙、0.8g双丙溶解于60mlDDW，调Vol到100ml

4.3MTris－HclbufferpH8.9100ml.

称Tris36.3g溶于水到100ml，调pH到8.9

5.0.5MTris－HclbufferpH6.7100ml

称Tris5.98g溶解后，调pH到6.7，调体积到100ml

6.Samplesbuffer10ml

7.电转液1LpH8.2－8.3

8.pH7.2PBS2L

9.10×电极缓冲液400mlpH8.4

10.脱色液1号

11.脱色液2号