关于全长cDNA文库构建试剂盒的问题
2021-08-08
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agarose313
用户
我用过Clonetech公司的SMART cDNA Library Construction Kit，Cat.No.K1051-1，效果挺好的，就是价格高7000圆人民币左右（2003年9月的价位），而且只能完整做5次（总RNA到第一链cDNA合成），PCR可以做15次，另外要提醒的是它不含噬菌体包装蛋白（Lambda DNA Packaging System）,如果你要建噬菌体文库，这是必须的，我当初买的普洛麦格（Promega公司）的k3154,效果还行，就是太少（6 extracts）。还有，做时不能完全安说明书来做，要根据自己的情况来决定具体的时间，否则永远都做不出来的，祝你好运！
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doublehorses
用户谢谢agarose313以后有问题会继续请教
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agarose313
用户“请教”二字可不敢当，共同探讨，共同进步！
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如风冷
用户请教agarose313，我现在也在用这个kit建库，不过合成的CDNA亮度不好，可是smear的长度还是可以的。这是怎么回事？我pcr已经用了24个循环了。
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agarose313
用户如果中间有明显亮带的话，就说明没有Overcycled，可以继续增加循环次数，我用的是30次循环。能否告知你的目的基因预测长度（因为建库的目的就是为了筛库来捕获目的基因）、变性时间和延长时间？你可以先试着用30cycles,不行就延长变性时间或者先加一个95℃，80sec的预变性，我当初从20cycles到30cycles，没有明显改变，后来大幅延长变性时间，才看到又亮又长的条带。你试一下先好啦。
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agarose313
用户昨晚我忘了说，你把产物量不高的那管pcr从-20℃取出来，追加一个95℃，80sec，6cycles（你的循环），如果循环次数不够是瓶颈环节的话，产物量会大幅提升，不过我没见你的图，不知道你所说的smear够长是多长，据我的一点经验，瓶颈环节应该是变性时间太短。
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如风冷
用户哦。谢谢。我是完全按照说明书做的。因为目前还没有要筛的基因，所以计划是要普遍筛的。我的smear是从100～5kb。你的意思是要追加95℃80s然后再进行6个95℃5s，68℃6min的循环吗？你能告诉我你的邮箱吗？我把图发给你看看吧。我不知道如何在这里贴图。
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agarose313
用户我的邮箱是lixj521@sina.com.cn如果你是完全按照说明书做的，而且smear又是从100~5K，亮度又不好，那和我开始做的征状相同，明显变性时间不够，追加循环是没有用的，建议将那管pcr从-20℃取出来，按下面的program再做一次（虽然它自己很没有信心地说它的Taq酶在95℃的Half-life为20～40min，但实践证明要大于此值）预测目的gene为1－5kb：●95℃for1min20sec●25cycles95℃for50sec68℃for6min●68℃for10min
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如风冷
用户谢谢agarose313。我先这样做一下。不过由于前面提的只是用DEPC处理水溶解后存于－70的，所以现在我的RNA有所降解，要重新提取。不知对于rna保存，你有什么高招吗？我上次用的rna只存了2个月就不好了。难道是提取的问题吗？可是我用的tip头ep管都严格处理了呀。
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agarose313
用户一次合成的CDNA第一链有10μl，而一次PCR只用2μl，怎么会用完。就是用完了也没有关系呀，把它们从-20℃冰箱中拿出来，就认为它们是新配好的PCR体系，直接放在PCR机里跑好啦，我试过的，结果影响不大。做RT-PCR最好用新鲜的RNA，超过一周即使没有降解我也不用。下面是我提RNA的一点体会，对于保存RNA我也没有办法：1）如果枪头和EP管是刚拆包的，就无需DEPC处理，处理后反而会破坏？硅化涂层？导致取液不准和挂液；镊子、装EP管的饭盒等要先用DEPC处理，然后再一起高温灭菌；2）戴橡胶手套，常用95%的酒精擦手、离心机、实验时用到的EP管架和实验操作区域。不要对着实验区域说话；离心时不能完全按说明书上写的时间，如果离心完管里还有液体就再离心一会。3）提到RNA后取一点测比值和浓度，然后立即开始下面的实验。
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agarose313
用户To如风冷:你好，很遗憾我未见到附件，无法分析评价。至于建库时的详细实验步骤我都写在实验纪录里，未输入电脑，现在又忙着筛库，所以对你的这个要求我只能说抱歉了，不过你也不用太担心，建库实验完整作一次后，你就会发现建库真的不能算难，尤其对于这么好的试剂盒来说。我的实验步骤99.9%是说明书上的步骤，只是在很小的细节有所改动。1）分级分离时gelmatrix一定要多放一点，至少过线。它说Anunsmoothmatrixsurfacedoesnothurtthefollowingfractionationprocess.这是不妥当的，gelmatrix一定要平，否则分级分离完后跑胶就不漂亮。2）跑胶后决定将某几个Tube中的CDNA混起来离心，移去上清时要将上清移入一个新的EP管中，以防把来之不易的cDNA沉淀扔掉。3）为了节约Packagingextract我采用的方法是在三个包装体系中各加33μl（总共用2extracts），总体系483μl，然后各取5μl稀释成100μl测滴度。得到最佳比例后，按这个比例包装剩下的4μlcDNA（这时候就千万别省啦）。成功的话，就不再需要Packagingextract啦，失败的话，只能重订啦，建议订11extracts的，稍微便宜一点。^_^就这些啦，其实我知道的并不比你多，所以就不要客气啦。祝你顺利！
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piscean
用户请问做RACE的试剂盒哪个牌子最好？-蚂蚁淘论坛
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agarose313
用户Topiscean--------------------------------------------------------------------------------我用过clontech的两个SMART产品，用的都是末端带GGG的，都挺好啊？--------------------------------------------------------------------------------愁情恨爱一消去，独历风风雨雨用过不早说，害我们新手在这里凑帖子。请教piscean，ELISA很阳的单克隆抗体做Westernblot，ECL发光法几乎什么都看不到，而同时ELISA弱阳的单克隆抗体做Westernblot却好的不得了，为什么？除了用单抗和天然构象protein与一级构象的结合力不同来解释，还有什么更有力的解释吗？先谢谢啦！
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如风冷
用户请教agarose313,配制四环素储存液时是不是要抽滤除菌啊。我买的四环素不是无菌包装的。谢谢了。
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agarose313
用户To如风冷对不起，我用的细菌是LE392，没用四环素，不知道怎么做。其它实验室的人没有抽滤除菌，不晓得对不对。
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