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赛默飞Qubit 4荧光计——DNA和RNA定量利器
来自 : 小蚂哥

新一代测序(NGS)实验中,我们需要将精确量的DNA文库分子上样到测序仪中。如果测序运行时的文库分子过多或过少,都会使数据质量受损。这不仅浪费宝贵的样本和试剂,也浪费我们和仪器的时间。对于芯片分析(Microarray)和实时定量PCR(qPCR)而言,精确测定样本中的DNA或RNA也是必需的。

以往我们大多采用分光光度计来测定260nm处的吸光度,对DNA和RNA进行定量。尽管这种方法被广泛采用,但并不意味着它的读数是准确而可靠的。紫外吸光度测量不具有选择性,无法区分DNA、RNA或蛋白质。而一些游离核苷酸或多余的盐离子也会影响检测的数值。此外,紫外分光光度计的灵敏度不足,无法完成低浓度DNA和RNA的精确定量。

qubit4荧光定量仪LifeTechnologies(赛默飞世尔旗下)的qubit4荧光定量仪正是基于此原理工作的。它采用荧光染料与特异的靶分子结合。只有当荧光染料与样本中的特异分子(DNA或RNA或蛋白质)结合时,才会发出荧光信号,从而大大提升了研究的准确性。并不是要推qubit4荧光定量仪,而是Qubit4的精准、灵敏等性能满足了新一代测序(NGS)实验。也就是说qubit4的诞生是必然的,qubit4荧光定量仪的与时俱进让它在新一代测序(NGS)实验中成为佼佼者,qubit4时代已经到来!


DNA或RNA的选择性PK

研究人员曾经做过实验,使用DNA和RNA含量相同的样本,利用qubit®dsDNABR分析试剂盒测定其中DNA的浓度,结果发现测量结果在实际含量的的±2%范围内,足以证明qubit®的厉害。之后,他们使用了RNA含量比DNA高10倍的样本,发现测得的DNA浓度仅比实际值高7%。再来看看分光光度计的表现吧。研究人员发现它们无法准确测定上述样本中DNA和RNA的含量(图下图)。好吧,第一回合qubit®获胜。

上图中,用qubit®dsDNABR和qubit®RNABR分析试剂盒及qubit®荧光计,按照试剂盒实验方案检测含有lamBDaDNA(10ng/μL)和不同量的大肠杆菌核糖体RNA(0-100ng/μL)的样本,每个样品重复3次。然后采用Nanodrop® ND-1000分光光度计检测同一样本三次,采用Perkinelmer®LamBDa35分光光度计检测一次。标示的浓度是在qubit®分析管中稀释前起始样本的DNA和RNA浓度。红色和橙色趋势线分别表示起始样本中DNA和RNA的实际含量。


低浓度下的准确性PK

研究人员之后采用qubit®dsDNAHS分析试剂盒及qubit®荧光计,定量浓度仅为10pg/μL的样本中的DNA,发现测得值在实际值的±12%范围内。而采用分光光度计测量上述相同样本,测得的浓度比实际值高46倍。而对于10ng/μL的样本,qubit®测得值在实际值的±1%范围内,而分光光度计测定的浓度在实际值的±5%范围内(如图)。显然,在样本浓度低的情况下,使用qubit®更为合适。

上图中.qubit®荧光定量的准确度和精度。根据标准试剂盒实验方案,在qubit®荧光计中采用qubit®dsDNAHS分析试剂盒重复10次测量浓度在0.01至10ng/μL之间的lamBDaDNA。同时采用NanoDrop®ND-1000分光光度计重复10次测量相同浓度的DNA,比较结果的准确度(A)和精度(B)。




样本浓度范围PK

 qubit的配套试剂盒有很多种,分别适合dsDNA、ssDNA、RNA、microRNA和蛋白质。其中,双链DNA分析试剂盒又分为高灵敏度(HS)和宽范围(BR)两种,适合10pg/μL至1μg/μL的DNA。与之类似,qubitRNAHS和BR分析试剂盒覆盖的样本浓度范围在250pg/μL至1μg/μL。而分光光度计的检测范围通常在2ng//μL至15μg/μL(如图)。由此可见,qubit适合的浓度范围更宽,不过,高浓度样本在分光光度计上测定就不必稀释。 




上图中.qubit®分析与采用NanoDrop®分光光度计进行紫外吸光度检测的样本浓度范围比较


其他方面PK

当然,分光光度计也有它的优势。全光谱吸光度读数可以通过吸收峰显示是否有污染物存在。另外,它的使用成本较低,上样、测定、擦拭即可,几乎不需要消耗品。而qubit®则需要购买配套的分析试剂盒。

想必大家还对第一代的qubit®荧光定量仪记忆犹新,活脱脱一个复活节的彩蛋嘛。如今,qubit®已经升级到3.0的版本,虽然没有之前那么萌,但易用程度再次升级。5.7英寸的彩色触摸屏方便设置和使用,更有多种操作语言供你灵活选择。全新的荧光计模式,使得您可以获得每个样本的原始荧光数据(RFU),配合Myqubit在线工具可以创建新的分析类型,不断扩展您的应用范围。qubit®3.0荧光定量仪采用强大的双核处理器,5秒内快速准确地定量DNA、RNA和蛋白。大尺寸的彩色触摸屏和Android系统,使得操作非常简单直观。浓度计算和设置都由仪器自动完成。若样本浓度处于延伸范围或超出范围,屏幕上均会有图形显示。

测量工作也很简单,所有qubit®试剂盒均采用相同的操作方案,只是孵育和读数稍有差异。其中DNA和RNA分析试剂盒仅需孵育2分钟,而蛋白分析试剂盒需要15分钟。1-20μL样本均可使用。qubit®最多可储存1000个样本结果,您可以通过U盘导出,也可以使用USB连接线直接与电脑相连。

如今,LifeTechnologies提供单台qubit®荧光定量仪、起始套装(包括四种分析试剂盒)以及NGS起始套装,供您选择。

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